豚鼠氣單胞菌鞭毛蛋白A基因的克隆與表達(dá).pdf

1、本研究以上海海洋大學(xué)分離自患出血敗血病的雜交鱘的豚鼠氣單胞菌XL2-T為實(shí)驗(yàn)菌株，以三個(gè)不同地域、來(lái)源的豚鼠氣單胞菌株為對(duì)照，對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)細(xì)菌學(xué)(Bacteriology)、病原學(xué)(Pathology)研究和(端生)單鞭毛(Single Polar flagella)蛋白A(flagellinA簡(jiǎn)稱FlaA)基因(flaA)的克隆和原核與真核表達(dá)。為今后豚鼠氣單胞菌亞單位基因工程疫苗開(kāi)發(fā)和在水產(chǎn)上的應(yīng)用進(jìn)行了有益的探索。 參

2、照相關(guān)文獻(xiàn)，應(yīng)用報(bào)道引物擴(kuò)增了不同豚鼠氣單胞菌flaA基因糖基化核心序列，經(jīng)分析，近N端氨基酸序列均為NAQRNLM：近C端均為QANQRC極為保守，中間為糖基化可變區(qū)。查閱Genebank，將公布的相關(guān)豚鼠氣單胞菌鞭毛基因應(yīng)用megalign采用CLUSTAL"W"method進(jìn)行alignment，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，擴(kuò)增得到flaA序列全長(zhǎng)，構(gòu)建了原核重組表達(dá)載體pET-28a+flaA和畢赤酵母(Pichia pastoris)分泌型

3、重組表達(dá)載體pPIC9K+flaA。 將重組表達(dá)載體pET-28a+flaA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，并免疫新西蘭兔制備抗血清，進(jìn)行了效價(jià)測(cè)定及細(xì)菌凝集試驗(yàn)。 將重組pPIC9K+flaA應(yīng)用限制性內(nèi)切酶BglII和SacI，在不同位點(diǎn)線性化，采用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，構(gòu)建MutS和Mut+重組表達(dá)菌株。應(yīng)用真核細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)原核FlaA結(jié)構(gòu)蛋白。 研究了豚鼠氣單胞菌(Arom

4、onas caviae)的適用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件及保存條件、菌落與細(xì)菌形態(tài)學(xué)、細(xì)菌生理生化鑒定、16SrDNA分子鑒定、運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)、相關(guān)毒力檢測(cè)、藥物敏感性檢測(cè)，研究的側(cè)重點(diǎn)為細(xì)菌鞭毛相關(guān)研究，包括鞭毛染色(silver stain和Lefison stain)、端生和側(cè)生鞭毛(polar and lateral flagella)的提取，應(yīng)用自制兔抗重組FlaA血清(anti-rcFlaA)進(jìn)行了鞭毛蛋白(flagella)蛋白質(zhì)印跡和