葡萄金黃化植原體基因芯片檢測技術(shù)及RFLP分析的研究.pdf

1、本研究通過對植原體15個組主要代表種的16SrDNA序列比對分析，設(shè)計植原體基因芯片引物及探針，以期為葡萄金黃化植原體（Flavescence dorée，F(xiàn)D）的檢測及植原體各亞型的鑒定提供一種快速、靈敏、高通量的檢測途徑。研究所設(shè)計的芯片引物擴增植原體得到的片段大?。s290bp）均與預(yù)期結(jié)果一致，說明所建立的熒光標(biāo)記PCR反應(yīng)體系正常；探針特異性檢測試驗表明：植原體屬探針（Phy探針）只有在檢測植原體時才出現(xiàn)陽性信號，F(xiàn)D探針只有

2、在檢測16SrV植原體時才出現(xiàn)陽性信號，PaWB探針只有在檢測泡桐叢枝?。≒aWB）植原體時才出現(xiàn)陽性信號，說明所設(shè)計的探針特異性強；靈敏度檢測試驗表明：利用FD基因擴增產(chǎn)物構(gòu)建質(zhì)粒檢測基因芯片的檢測靈敏度達模板量103拷貝/mL，靈敏度要高于普通PCR，且通過檢測結(jié)果可直接對不同植原體種做出準(zhǔn)確鑒定，還具有可同時檢測多種樣品中不同病原的特點；芯片穩(wěn)定性驗證結(jié)果表明：本研究所設(shè)計的芯片重復(fù)性好、穩(wěn)定性強，相同雜交條件下，批次內(nèi)和批次間的

3、基因芯片都可檢測到明顯的雜交信號，但不同批次及批次間的芯片檢測信號存在一定差異，只可做定性判定；對芯片的最佳雜交時間、雜交溫度、雜交液成分設(shè)不同梯度進行優(yōu)化，確定雜交溫度45℃，雜交時間1h，雜交液2.5%甲酰胺，0.2%SDS，6×SSC為最佳雜交體系。最終成功構(gòu)建了FD基因芯片檢測體系。
　　 采用植原體通用引物R16mF2/R16mR1對16SrV植原體進行擴增，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒，并序列測定，測定結(jié)果與GenBank公布序

4、列一致。用Xmn I、XspI、Taq I和Rsa I 4種限制性內(nèi)切酶對所擴增的16SrV植原體16SrDNA進行酶切，瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明：除葡萄金黃化C型（FD-C）和懸鉤子矮化（RUS）植原體之間沒有出現(xiàn)可相互區(qū)分的特異性條帶外，其它各植原體之間都可以通過特異性條帶的比較進行區(qū)分；Taq I和Rsa I兩種限制性內(nèi)切酶分別對16SrV-D和16SrV-B亞組的植原體特異。
　　 對新疆主要葡萄種植區(qū)進行葡萄黃化類植原