葡萄金黃化植原體基因芯片檢測(cè)技術(shù)及RFLP分析的研究.pdf

1、本研究通過對(duì)植原體15個(gè)組主要代表種的16SrDNA序列比對(duì)分析，設(shè)計(jì)植原體基因芯片引物及探針，以期為葡萄金黃化植原體（Flavescence dorée，F(xiàn)D）的檢測(cè)及植原體各亞型的鑒定提供一種快速、靈敏、高通量的檢測(cè)途徑。研究所設(shè)計(jì)的芯片引物擴(kuò)增植原體得到的片段大小（約290bp）均與預(yù)期結(jié)果一致，說明所建立的熒光標(biāo)記PCR反應(yīng)體系正常；探針特異性檢測(cè)試驗(yàn)表明：植原體屬探針（Phy探針）只有在檢測(cè)植原體時(shí)才出現(xiàn)陽性信號(hào)，F(xiàn)D探針只有

2、在檢測(cè)16SrV植原體時(shí)才出現(xiàn)陽性信號(hào)，PaWB探針只有在檢測(cè)泡桐叢枝?。≒aWB）植原體時(shí)才出現(xiàn)陽性信號(hào)，說明所設(shè)計(jì)的探針特異性強(qiáng)；靈敏度檢測(cè)試驗(yàn)表明：利用FD基因擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建質(zhì)粒檢測(cè)基因芯片的檢測(cè)靈敏度達(dá)模板量103拷貝/mL，靈敏度要高于普通PCR，且通過檢測(cè)結(jié)果可直接對(duì)不同植原體種做出準(zhǔn)確鑒定，還具有可同時(shí)檢測(cè)多種樣品中不同病原的特點(diǎn)；芯片穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果表明：本研究所設(shè)計(jì)的芯片重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)，相同雜交條件下，批次內(nèi)和批次間的

3、基因芯片都可檢測(cè)到明顯的雜交信號(hào)，但不同批次及批次間的芯片檢測(cè)信號(hào)存在一定差異，只可做定性判定；對(duì)芯片的最佳雜交時(shí)間、雜交溫度、雜交液成分設(shè)不同梯度進(jìn)行優(yōu)化，確定雜交溫度45℃，雜交時(shí)間1h，雜交液2.5%甲酰胺，0.2%SDS，6×SSC為最佳雜交體系。最終成功構(gòu)建了FD基因芯片檢測(cè)體系。
　　 采用植原體通用引物R16mF2/R16mR1對(duì)16SrV植原體進(jìn)行擴(kuò)增，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒，并序列測(cè)定，測(cè)定結(jié)果與GenBank公布序

4、列一致。用Xmn I、XspI、Taq I和Rsa I 4種限制性內(nèi)切酶對(duì)所擴(kuò)增的16SrV植原體16SrDNA進(jìn)行酶切，瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明：除葡萄金黃化C型（FD-C）和懸鉤子矮化（RUS）植原體之間沒有出現(xiàn)可相互區(qū)分的特異性條帶外，其它各植原體之間都可以通過特異性條帶的比較進(jìn)行區(qū)分；Taq I和Rsa I兩種限制性內(nèi)切酶分別對(duì)16SrV-D和16SrV-B亞組的植原體特異。
　　 對(duì)新疆主要葡萄種植區(qū)進(jìn)行葡萄黃化類植原