葡萄金黃化植原體的分子檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、2007～2008年，對(duì)新疆主要葡萄種植區(qū)的葡萄植原體黃化病發(fā)生情況進(jìn)行了田間調(diào)查和采樣。通過對(duì)采集的191個(gè)樣品進(jìn)行巣式PCR檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)樣品中帶葡萄黃化植原體。 選用文獻(xiàn)報(bào)道的兩對(duì)引物(R16mF2/R16mR2、R16F2/R16R2)對(duì)葡萄金黃化植原體分別進(jìn)行常規(guī)PCR和巢式PCR檢測(cè)；并對(duì)兩種方法的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行了比較。結(jié)果表明：引物R16mF2/R16mR2檢測(cè)的最小DNA模板量為20ng/μL，以常規(guī)PCR產(chǎn)物為模板

2、的巢式PCR選用兩對(duì)引物大大增加了檢測(cè)的可靠性，檢測(cè)靈敏度提高了約10000倍；同時(shí)對(duì)PCR的反應(yīng)條件優(yōu)化，創(chuàng)建了最優(yōu)的PCR反應(yīng)條件；巢式PCR檢測(cè)時(shí)間約為5h。 用植原體通用引物P1/P7擴(kuò)增葡萄金黃化植原體基因組DNA，并克隆測(cè)序。得到的序列與GeneBank中其它植原體16SrRNA序列比對(duì)，利用DNASTAR軟件構(gòu)建了同源關(guān)系樹，對(duì)供試菌株進(jìn)行了分類與鑒定。 根據(jù)葡萄金黃化植原體與其它植原體組16SrDNA序列

3、差異，設(shè)計(jì)出對(duì)葡萄金黃化植原體具有穩(wěn)定點(diǎn)突變的特異性引物FDF09/FDR09和TaqMan探針FDX-Probe；通過優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，建立了針對(duì)葡萄金黃化植原體的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法；特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示：該檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，除葡萄金黃化植原體有熒光信號(hào)增強(qiáng)外，其它植原體和細(xì)菌材料均無熒光信號(hào)增強(qiáng)；該檢測(cè)方法對(duì)FD-質(zhì)粒DNA的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.56fg/reaction；重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示該檢測(cè)方法重復(fù)性高