炭疽芽胞桿菌染色體特異序列篩選及其實時定量PCR檢測.pdf

1、炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)是一種大型的革蘭氏陽性桿菌，是引起人類及動物烈性傳染病——炭疽的病原體。在自然界中炭疽桿菌主要以芽孢形式的存在于土壤、動物糞便和空氣中，由于炭疽芽胞桿菌致命的致病力和炭疽芽孢對自然環(huán)境強大的抵抗力，炭疽一直是世界上研究最多分布最廣的頭號生物戰(zhàn)劑。早期快速特異檢測空氣、土壤、水源以及可疑標本中的炭疽芽孢桿菌可以有效降低感染人群的死亡率、阻斷病原的更大規(guī)模擴散，是國家防生應(yīng)急體系的核心環(huán)節(jié)，

2、具有非常重大的意義。 檢測炭疽芽胞桿菌的方法主要有基于培養(yǎng)和生化鑒定的傳統(tǒng)實驗室方法、基于抗原抗體結(jié)合的免疫學(xué)方法和基于基因組特異序列的核酸檢測方法。核酸檢測方法特異性強，速度快，技術(shù)成熟，標本中的炭疽芽胞桿菌在生物安全實驗室中進行核酸釋放處理階段通常被滅活，相對其它檢測方法更安全?；赥aqMan探針技術(shù)的實時定量PCR方法檢測靈敏度高、結(jié)果穩(wěn)定，引物、探針和模板序列之間的雙重特異性克服了傳統(tǒng)PCR的缺陷，是炭疽芽胞桿菌的快速

3、檢測比較理想的技術(shù)手段。 一種核酸檢測方法通常面臨的核心問題是如何選擇針對檢測物種特異的核酸檢測靶點。不同于其它菌種，炭疽芽胞桿菌與自然界中廣泛分布的臘樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌等菌種同屬于臘樣芽胞桿菌群，這些近源菌種在核酸水平具有相當高的同源性，傳統(tǒng)的菌種鑒定標志如16sRNA序列、23sRNA序列、16/23sRNA間隔區(qū)序列在這些菌種之間僅具非常微小的差異，這決定了尋找炭疽芽胞桿菌染色體特異序列(genomi

4、csignatures)具有較大的挑戰(zhàn)性。早期的炭疽芽胞桿菌核酸檢測方法大都選擇炭疽芽胞桿菌攜帶的兩個毒性質(zhì)粒pX01和pX02作為特異檢測靶點，但是毒性質(zhì)粒并不穩(wěn)定，容易缺失，轉(zhuǎn)移和突變。大量研究已經(jīng)證明，盡管炭疽芽胞桿菌和其近源菌種具有很高的同源性，但是它們的基因組序列之間確實存在散在分布的差異序列。因此，在相對保守的染色體上尋找、選擇炭疽芽胞桿菌獨有的特異序列(genomicsignatures)作為檢測靶點，再利用高度敏感特異的

5、熒光定量PCR技術(shù)建立炭疽芽胞桿菌核酸檢測方法，既可以提高檢測的特異性，又可以克服以往僅依靠毒性質(zhì)粒pX01和pX02的檢測方法的局限性。因此，該方法近年來被廣泛應(yīng)用于炭疽芽胞桿菌快速檢測，一些染色體特異檢測序列也見諸報道，但后續(xù)研究相繼證實這些序列的檢測靈敏度、特異性以及檢測速度不夠理想。為了尋找新的炭疽芽胞桿菌染色體特異檢測序列，本研究從117段炭疽芽胞桿菌染色體特異序列中篩選出6段最優(yōu)序列，設(shè)計TaqMan探針和引物，建立了一種快

6、速、準確、特異定量檢測炭疽芽胞桿菌的新方法 一、炭疽芽胞桿菌染色體特異序列的篩選及驗證。 對文獻報道的共117段炭疽芽胞桿菌染色體特異序列進行兩次篩選。首先利用NCBIBLAST-tn比對所有候選序列，篩選出完全符合GenBank數(shù)據(jù)庫中炭疽芽胞桿菌基因組數(shù)據(jù)的候選序列。序列入選條件：與GenBank中炭疽芽胞桿菌基因組具100％同源性(BLASTE-value=0)；與其它物種尤其是炭疽芽胞桿菌近源菌種不具有或僅具極低

7、同源性(BLASTE-value≥0.1)，符合條件的序列可認為具有較理想的理論特異性。其次，為了得到適合TaqMan實時定量PCR檢測方法目標序列，在滿足特異性的基礎(chǔ)上還必須根據(jù)TaqMan復(fù)合探針和引物的設(shè)計的原則，對這些序列進行二次篩選。由于第一次篩選中得到的部分特異片段長度較短(小于200bp)，難以同時找出理想的引物對和探針，根據(jù)GenBank中炭疽芽胞桿菌全基因組序列向其3’和5’端各延伸200bp得到600bp左右的加長序

8、列(expandedsequence)，并再次利用第一步的篩選方法和入選條件驗證這些加長序列的特異性。最終共從117段候選序列中得到了11段具有100％同源性和8段具有99％以上同源性的炭疽芽胞桿菌基因組特異序列。根據(jù)TaqMan探針和引物設(shè)計條件從11段100％特異序列中篩選出6段(C01-C06)既滿足炭疽芽胞桿菌特異性又符合TaqMan探針和引物設(shè)計原則的特異序列。利用Oligo6.0軟件人工設(shè)計6段特異序列及pagA基因、cap

9、B基因的TaqMan探針和引物，所有探針、引物及理論擴增片段序列再經(jīng)BLAST-tn驗證具100％特異性。 二、炭疽芽胞桿菌常規(guī)PCR、雙重PCR、實時熒光定量PCR檢測方法的建立及模擬污染標本的檢測 為了驗證所設(shè)計引物的特異性和靈敏性，并從6套基因組特異序列引物探針中選擇一套相對較好的方案用于實時定量檢測，將所有8對引物(C01～C06片段、pagA、capB)分別對不同濃度、不同方法抽提的炭疽芽胞桿菌基因組DNA及其

10、它近源菌株基因組DNA進行常規(guī)PCR反應(yīng)，經(jīng)多輪反應(yīng)條件優(yōu)化后選定特異性較好，擴增效果穩(wěn)定的C04片段用于定量PCR檢測方法；進一步對基于C04片段與capB、pagA基因的雙重及多重PCR的反應(yīng)條件和檢測結(jié)果進行優(yōu)化和分析，建立了C04片段與capB基因的雙重PCR檢測體系。繼而利用C04片段與炭疽芽胞桿菌毒性質(zhì)粒pX01、pX02上的pagA、capB基因建立實時定量PCR檢測體系。經(jīng)實驗證實本體系的檢測靈敏度達到每PCR反應(yīng)10～

11、100個拷貝，利用12種相關(guān)菌株評價后獲得100％特異性。在此基礎(chǔ)上利用10份炭疽芽胞桿菌污染的生活用水和土壤標本以及20份對照標本驗證本體系的檢測能力，結(jié)果顯示所有污染標本均被檢出，所有對照標本均為陰性。 小結(jié)： 1.本實驗篩選117段炭疽芽胞桿菌特異序列，經(jīng)雙重特異性驗證后得到19段比較理想的炭疽芽胞桿菌特異序列，根據(jù)TaqMan探針引物設(shè)計原則選擇其中6段設(shè)計TaqMan實時定量PCR檢測方案。 2.經(jīng)常規(guī)

12、PCR和雙重PCR實驗，優(yōu)選其中的C04片段建立了TaqMan熒光定量PCR檢測體系。經(jīng)實驗驗證，本體系具有較理想的檢測靈敏度和特異性，整個檢測過程可以在4小時以內(nèi)完成，而基于C04、capB基因序列建立的雙重PCR檢測體系不僅可以用作一種基于普通PCR儀的檢測方法，更為進一步研究炭疽芽胞桿菌多重實時定量PCR檢測方法奠定了基礎(chǔ)；此外，C04片段作為一種全新的特異序列用于炭疽芽胞桿菌實時定量PCR檢測，國內(nèi)外均未見報道。研究得到的19段