siRNA對SARS冠狀病毒復(fù)制的抑制作用研究.pdf

1、嚴重急性呼吸綜合征(SevereAcuteRespiratorySyndrome，SARS)是人類在2l世紀初遭遇的烈性傳染病之一，我國為該病的重要疫區(qū)。其病原體為SARS冠狀病毒(SARSCoronavirus，SARS-CoV)。目前對其尚無特效的治療方法，因而探索有效的抗SARS病毒新途徑勢在必行。 RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是基于RNA水平的抗病毒策略，憑借自身的特異、高效、快速等優(yōu)勢，它已成

2、為抗病毒領(lǐng)域的研究熱點之一。RNAi的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用為治療SARS病毒感染提供了新思路。 本研究擬開展以下兩方面內(nèi)容，觀察siRNA對SARS病毒復(fù)制的抑制作用。探索抗SARS病毒感染的新途徑。 一.siRNA的設(shè)計合成及其對SARS病毒部分復(fù)制酶基因的抑制作用 由于復(fù)制酶基因的表達是SARS病毒啟動轉(zhuǎn)錄的前提，而刺突蛋白在病毒入侵宿主細胞的過程中發(fā)揮著重要作用，因此選擇SARS病毒復(fù)制酶基因(rep)和刺突蛋白基因

3、(s)的保守序列作為靶基因，設(shè)計并合成9種siRNA(pS01～09)，其中pS01～07針對rep基因，pS08～09針對s基因。由于體外合成的siRNA不易操作且基因干涉作用持續(xù)時間短，故采用構(gòu)建siRNA表達載體的方法在體內(nèi)合成siRNA。 同時，構(gòu)建融合表達綠色熒光蛋白(GFP)基因和部分rep基因的重組載體，將已構(gòu)建好的識別rep基因的siRNA表達載體與重組載體共轉(zhuǎn)染293T細胞，通過熒光顯微鏡觀察和流式細胞儀分析融

4、合基因的表達情況。結(jié)果表明，針對SARS病毒rep基因第3504nt-3522nt的siRNA可使rep基因的表達量下降33％，說明siRNA可特異而有效地抑制基因的表達。 二.siRNA在Vero細胞中的抗SARS病毒作用 為進一步研究siRNA對SARS病毒復(fù)制的抑制作用，將構(gòu)建的siRNA表達載體分別轉(zhuǎn)染Vero細胞，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄siRNA的克隆細胞株V/pS01、03、05～09及對照細胞株V/pSN，然后以BJ

5、01株病毒懸液感染克隆細胞，通過病毒滴度測定和間接免疫熒光實驗觀察siRNA對SARS病毒復(fù)制的抑制作用。結(jié)果表明，針對rep基因和s基因的siRNA(pS05和pS08)呈現(xiàn)出了良好的抗病毒效果，在接種SARS病毒后均未檢測到病毒的特異性抗原，且病毒滴度下降103～104倍。另外，通過實時定量RT-PCR檢測病毒感染的細胞上清中rep基因的含量，結(jié)果顯示，細胞株V/pS05中rep基因含量僅為對照組的1/1000倍。表明rep基因的缺