雞原始生殖細胞形成過程中C2EIP功能及其調控機制的研究.pdf

1、PGCs(Primordial germ cells，PGCs)是精子和卵子的祖細胞，能夠將遺傳信息從親代傳遞給子代的干細胞，保證了種系間遺傳物質的穩(wěn)定傳遞。近年來，通過探究PGCs發(fā)生的具體過程，揭示生殖細胞發(fā)育過程中關鍵基因的分子作用及其機制已逐漸成為生殖生物學領域中的研究熱點。研究PGCs分化具有重要意義:(1)對畜牧學而言，研究動物生殖干細胞分化過程有助于解決畜牧種質的選配選育問題;(2)對人類而言，詳細了解生殖分化機理能夠為不

2、孕不育等疾病提供根本解決方法。然而無論是解決哪方面的問題，都需要建立在全面了解生殖過程中細胞發(fā)育事件和相關基因作用機制的基礎上，只有這樣才能從根本上解決畜牧學和人類生殖相關性狀的相關問題。
　　然而，目前由于對PGCs的發(fā)育調控機制缺乏深入探索，導致體外誘導效率低下，難以獲得數(shù)量多且質量高的PGCs，極大的限制了PGCs的利用;因此，亟需對PGCs的發(fā)生發(fā)育機理進行深入的研究?；诖?，本課題組前期已經對體內正常發(fā)育過程中的胚胎干細

3、胞(Embryonic stem cells，ESCs)、PGCs和精原干細胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)進行了全基因組轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)了一些影響PGCs形成的關鍵基因和關鍵信號通路，而C2EIP(Chromosome2，Expression In PGCs)就是其中一個最具有顯著性差異表達的關鍵基因;C2EIP在PGCs中高表達，而在ESCs和SSCs中低表達，推測該基因可能參與了PGCs的發(fā)育調控

4、。
　　為了系統(tǒng)的研究C2EIP基因的功能。本研究中，我們以家雞為研究對象探索C2EIP在PGCs形成過程中的功能;利用CRISPR/Cas9基因編輯技術研究C2EIP基因的作用以及研究C2EIP在不同細胞中差異表達的影響因素;利用GST-Pull Down，質譜分析，免疫共沉淀等實驗技術研究C2EIP的分子調節(jié)機制。
　　研究結果如下:
　　(1) C2EIP的發(fā)現(xiàn)、克隆及生物信息學分析對ESCs、PGCs和SSCs

5、的轉錄組測序結果進一步分析發(fā)現(xiàn)C2EIP在PGCs中特異高表達，在ESCs和SSCs中不表達，RT-PCR驗證結果與轉錄組測序結果一致;生物信息學預測結果發(fā)現(xiàn)C2EIP主要在細胞質中表達，存在磷酸化和糖基化位點;C2EIP CDS序列在不同物種間保守型較差，禽類中保守性較高;C2EIP具有泛素化連接酶E3和磷酸化雷帕霉素靶蛋白復合體功能，初步推斷C2EIP行使類似酶的功能;
　　(2) CRISPR/Cas9基因編輯技術介導家雞C

6、2EIP敲除體系建立根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫提供的C2EIP CDS序列，設計3個gRNA靶位點，命名為gRNA1，gRNA2，和gRNA3并連入改造后的VK001-08載體中，通過SSA活性檢測發(fā)現(xiàn)gRNA3對靶位點的敲除活性(Value:0.6924±0.07)是對照組(Value:0.3724±0.12)的近2倍(P＜0.01)，但gRNA1(Value:0.3813±0.27)和gRNA2(Value:0.3718±0.09)對相應靶

7、位點的敲除活性與對照組(Value:0.3912±0.32)之間相比沒有差異(P＞0.05)，即沒有敲除活性;將CRISPR/Cas9-gRNA3轉染生長狀態(tài)良好的DF-1細胞后提取DNA，通過T7E1酶切檢測發(fā)現(xiàn)gRNA3在DF-1細胞中對C2EIP的敲除效率為27％，TA克隆測序結果表明30個測序菌液中有8個菌液出現(xiàn)不同數(shù)目的堿基缺失或增加，初步估計基因敲除效率為26％;將CRISPR/Cas9-gRNA3轉染生長狀態(tài)良好的ESCs

8、后進行T7EI酶切檢測發(fā)現(xiàn)敲除效率為20％，同時CRISPR/Cas9-gRNA3能夠在雞胚中順利表達并在心臟表達水平最高，且載體在雞胚中整合后基因敲除效率達15％;
　　(3)體內外研究C2EIP在PGCs形成過程中的功能克隆C2EIP CDS全長，并成功構建PCDNA3.0-C2EIP過表達載體和C2EIP-N1融合表達載體;C2EIP-N1融合表達載體轉染DF-1后觀察綠色熒光蛋白表達位置，發(fā)現(xiàn)C2EIP在細胞質中表達;針對

9、C2EIP CDS序列，設計抗原表位，合成多肽并腹腔免疫小鼠制備單克隆抗體，IFA檢測抗體效價為1∶10，且抗體抗原反應也發(fā)生在細胞質中;通過體內和體外兩個水平研究C2EIP在PGCs形成過程中的功能，結果發(fā)現(xiàn):體外實驗過程中，在過表達組誘導6天后能出現(xiàn)生殖樣細胞，且生殖標記基因有顯著性的上調表達(P＜0.01)，敲除組在相同的情況下則不能。流式細胞分選結果表明基因敲除后CVH陽性細胞數(shù)量減少(4.8±0.16％)，過表達反而增加(18

10、.6±0.13％)，熒光定量實驗結果也顯示C2EIP敲除后PGCs的標記基因Cvh的表達(Value:2.8254±0.31)與正常組(Value:3.1425±0.66)相比出現(xiàn)了顯著的下調(P＜0.01);體內實驗過程中，注射過表達載體后的雞胚發(fā)育與對照相比沒有顯著差異，但是在第4.5天Cvh的表達顯著提高(P＜0.01)。對4.5天的雞胚進行冰凍切片后利用Cvh和C-KIT特異抗體進行免疫組化實驗，結果表明注射敲除載體后產生的PG

11、Cs數(shù)量顯著的低于正常發(fā)育組和注射過表達載體的實驗組。正常組和過表達組中腎發(fā)育完全可見，而在敲除組中無法觀察到完整的中腎結構;
　　(4)探索影響C2EIP差異表達的因素克隆C2EIP啟動子序列并連入EGFP-N1載體構建P C2EIP-E GFP表達載體，瞬時轉染DF-1后可以觀察到EGFP綠色熒光，這就說明克隆的C2EIP啟動子區(qū)域具有啟動活性;通過5'端逐步缺失技術克隆C2EIP啟動子不同長度片段，并構建PGL3/787(-

12、891～-94bp)、PGL3/588(-682～-94bp)、PGL3/374(-468～-94bp)、PGL3/170（-264～-94bp）載體，并通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)C2EIP啟動子核心區(qū)域為-264～-94bp;對啟動子核心區(qū)域進行轉錄因子結合位點預測發(fā)現(xiàn)STAT1、STAT10、Sox17、Sox2和Klf5轉錄因子結合位點，對這些位點進行點突變實驗同時構建相應轉錄因子過表達載體，通過雙熒光素報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)STAT1

13、能夠正向調節(jié)C2EIP啟動子活性;STAT10，Sox17，Sox2和Klf5負向調節(jié)C2EIP啟動子活性;在轉染了PGL3/787載體的DF-1細胞的培養(yǎng)基中分別添加TSA和5Azacd，雙熒光素報告系統(tǒng)檢測結果表明:降低DNA甲基化水平和提高組蛋白乙?；侥軌蛱岣逤2EIP啟動子活性;
　　(5)研究C2EIP調節(jié)PGCs形成過程的分子調控機制構建C2EIP的原核融合表達載體，并進行IPTG誘導表達和純化，C2EIP原核融合

14、表達載體能夠在原核表達菌株中順利表達;通過GST-Pull Down和質譜分析成功獲取與C2EIP蛋白的互作蛋白，分別是: PTCH2，KRT75, H2B-Ⅷ, KRT12, Histone H3, SLC25A6, LYZ, VDAC2, HistoneH1,EF-1α, KRT19;通過Western Blot，Co-IP和間接免疫熒光驗證了GST-Pull Down互作的準確性并確認C2EIP與PTCH2蛋白在細胞內膜發(fā)生互作形

15、成復合物;通過Co-IP技術對體外和體內不同C2EIP處理下的PTCH2進行沉淀并通過Western Blot檢測PTCH2的磷酸化和泛素化水平變化，結果發(fā)現(xiàn):高表達C2EIP能夠降低PTCH2蛋白的磷酸化水平和降低PTCH2蛋白泛素化水平;成功構建PTCH2干擾表達載體shRNA-PTCH2-1，shRNA-PTCH2-2，shRNA-PTCH2-3;同時驗證出shRNA-PTCH2-3對PTCH2蛋白具有較好的抑制效果;通過體內和體

16、外驗證實驗發(fā)現(xiàn):抑制HH信號通路能夠抑制PGCs的形成（RA:3.8±0.23％;RA+shRNA-IHH:12.9±0.08％;P＜0.01），反之，激活HH信號通路則能夠促進PGCs的形成（RA:3.8±0.23％;RA+shRNA-PTCH2:15.6±0.17％; P＜0.01），結合上述實驗結果分析發(fā)現(xiàn)IHH與PTCH2蛋白結合，改變PTCH2活性成分表達水平從而調節(jié)HH信號參與PGCs形成，而C2EIP也可以與PTCH2結合