幾株蛹草擬青霉原生質(zhì)體制備及染色體核型研究.pdf

1、本文對(duì)蛹蟲草無性型蛹草擬青霉的產(chǎn)孢培養(yǎng)基、酶解條件、原生質(zhì)體制備等方面進(jìn)行了研究，同時(shí)以溫漢遜氏酵母Hansenula wingei YB-4662-VIA和粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe972h-染色體DNA作為標(biāo)準(zhǔn)指示樣品，利用等強(qiáng)度均一電場(chǎng)(Contour-clamped Homogeneous Electric Field，CHEF)凝膠電泳技術(shù)比較了蛹草擬青霉菌株的電泳核型。
　　 培養(yǎng)

2、基對(duì)菌株產(chǎn)孢量的影響實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，除了菌株RCEF0848外基本上都以SMAY培養(yǎng)基最好，產(chǎn)孢量最大，菌株RCEF0848的產(chǎn)孢量以在察氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)后的產(chǎn)孢量最大。
　　 酶解過程中存在著各種影響因素，包括酶的選擇、酶反應(yīng)溫度、酶反應(yīng)時(shí)間等。總體上混合酶液的效果好于單一酶類的作用效果。用相同濃度的蝸牛酶、纖維素酶和溶壁酶混合配成的酶解液酶解效果最佳；酶反應(yīng)溫度在30～35℃溫度范圍內(nèi)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量相差不多，高于或低于這個(gè)范圍時(shí)

3、原生質(zhì)體產(chǎn)量都會(huì)下降，但通過后期實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)考慮到原生質(zhì)體的質(zhì)量，選擇31℃為最適反應(yīng)溫度，在120r/min的條件下震蕩處理2.48h即可獲得大量的原生質(zhì)體，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下好的基礎(chǔ)。
　　 原生質(zhì)體產(chǎn)生過程中觀察到一系列現(xiàn)象：原生質(zhì)體在釋放過程中體積變化較大，大小各不一致，前期產(chǎn)生的原生質(zhì)體直徑較小，后期產(chǎn)生的原生質(zhì)體直徑較大。原生質(zhì)體在釋放過程中主要有頂端、側(cè)位、及原位三種釋放方式，釋放后期基本以原位釋放為主。另外，還發(fā)現(xiàn)一

4、種現(xiàn)象，即當(dāng)兩個(gè)原生質(zhì)體靠的很近時(shí)，兩者可以發(fā)生自然融合現(xiàn)象。
　　 經(jīng)過對(duì)電泳條件的多次篩選，認(rèn)為最理想的電泳條件是分兩個(gè)階段進(jìn)行，以利于大小條帶的分離。兩個(gè)階段分別從電泳時(shí)間、電泳液的溫度、電泳緩沖液的種類、瓊脂糖濃度、電壓、脈沖轉(zhuǎn)換的時(shí)間、轉(zhuǎn)換的角度等方面考慮。第一階段：時(shí)間為48h，溫度14℃，電泳緩沖液1×TAE，瓊脂糖濃度0.8％，電壓2v/cm，脈沖時(shí)間20～30min，轉(zhuǎn)換角度106°:第二階段：16h，14℃，

5、1×TAE，0.8％，3v/cm，500s,106°。
　　 以標(biāo)準(zhǔn)指示(marker)樣品估算蛹草擬青霉的染色體大小和核型大小，結(jié)果為：蛹草擬青霉RCEF0096最小的染色體估算其大小為2.04Mb，最大的染色體估算大小為5.76Mb，整個(gè)染色體條帶在31.0Mb以上；菌株RCEF4544染色體DNA最大及最小分別為5.69、2.04Mb，整個(gè)染色體條帶在28.2Mb以上；菌株RCEF0848染色體DNA大小在2.0～5.7M

6、b，整個(gè)染色體條帶在28.0Mb以上。故推算蛹草擬青霉基因組大小在28.0～31.0Mb。
　　 核型分析表明蛹草擬青霉種內(nèi)各菌株間核型存在一定的差異，呈現(xiàn)明顯的多態(tài)性，與其生存環(huán)境、寄主的多樣性、以及培養(yǎng)過程中易退化等等因素有著微妙的關(guān)聯(lián)。但各個(gè)菌株間最大染色體DNA大小和最小染色體DNA大小的估算值接近，同時(shí)條帶的個(gè)數(shù)也是相同的。說明這種差異從某個(gè)角度來說是不那么顯著的，這也與文獻(xiàn)中指出的真菌電泳核型差異是種間大于種內(nèi)、屬間