鱖SID-1和NCBP2基因的功能研究.pdf

1、為了研究病毒與宿主的相互作用,在傳染性脾腎壞死病毒(Infectious Spleenand Kidney Necrosis Virus,ISKNV)感染鱖(Siniperca chuatsi)的抑制性消減cDNA文庫基礎上,經(jīng)比對分析后發(fā)現(xiàn),系統(tǒng)性RNAi缺陷相關基因1(Systemic RNAInterference Defective1,SID-1)和核帽結(jié)合蛋白2(Nuclear Cap-Binding Protein2,NCB

2、P2)兩個表達序列標簽(Expression Sequence Tag,EST)在病毒抗性鱖魚中表達上調(diào)。為探討兩者在宿主抵抗病毒感染中的作用,采用RACE技術調(diào)取了兩條基因全長cDNA序列。
　　 鱖SID-1 cDNA序列長3380 bp,編碼855個氨基酸。氨基酸序列與其它脊椎動物SID-1相似性在70％以上,而與家蠶(Bombyx mori)、赤擬谷盜(Tribolium castaneum)等相似性較低,在40％以下。

3、預測分析顯示,SID-1蛋白N末端310個氨基酸呈無規(guī)則卷曲位于細胞膜外側(cè),隨后為9個復雜的跨膜結(jié)構(gòu)域,C末端位于細胞內(nèi),其結(jié)構(gòu)在親緣關系近的生物中高度保守。熒光實時定量PCR分析表明,SID-1在鱖魚體內(nèi)廣泛表達,其中以肌肉、血細胞中最高,其它免疫器官頭腎、后腎、肝臟、脾臟及性腺中表達量也較高,而在心、腦、腸、皮及鰓中表達量較低。表達譜分析表明,ISKNV感染后,SID-1表達在血細胞、脾臟、鰓組織中呈現(xiàn)大致相同的規(guī)律,在感染后第3天

4、上升到最高,隨后表達水平逐步下降,第7天恢復到原有水平。而在頭腎中則呈相反的表達規(guī)律,在感染后第7天到達高值,并在表現(xiàn)ISKNV抗性的魚中表達量最高,這可能與魚類頭腎在免疫反應過程中的重要地位有關。在體外細胞進行的實驗則呈現(xiàn)獨特的規(guī)律,首先是在病毒感染后第1天小幅下降,隨后隨著感染天數(shù)的增加,其轉(zhuǎn)錄水平一直穩(wěn)定增加,可能與體外條件下,缺乏生物體內(nèi)復雜的調(diào)控機制有關。
　　 亞細胞定位分析表明,SID-1主要在細胞膜,在細胞內(nèi)部分

5、區(qū)域呈點狀聚集高表達。利用果蠅表達系統(tǒng)的分析表明,SID-1基因轉(zhuǎn)染果蠅S2細胞后,可以高效的將dsRNA由培養(yǎng)液轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi),而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組不具此能力。對FHM細胞的分析表明,FHM細胞本身即具備由培養(yǎng)液中攝取dsRNA的能力,但穩(wěn)定表達SID-1基因后,其轉(zhuǎn)運能力可提高5-9倍。利用G418篩選獲得了穩(wěn)定表達鱖SID-1基因的FHM細胞系,TFV感染實驗顯示,在培養(yǎng)液中添加TFV病毒ORF097基因的dsRNA條件下,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SID

6、-1基因可將細胞病變時間推后3天；在不添加dsRNA條件下,也可將細胞病變時間推后2天。進一步熒光實時定量PCR、western blot及病毒滴度測定均顯示,SID-1基因穩(wěn)定表達細胞系病毒量均低于對照組,特別是在添加TFV病毒dsRNA的情況下,SID-1基因穩(wěn)定表達細胞系病毒量遠遠低于對照組,在病毒感染后第2、3天對照組較實驗組病毒量高100倍以上(1.36E+00/1.11E-02、2.19 E+00/1.45E-02)。利用S

7、ID-1基因原核表達抗原片段,制備了抗SID-1蛋白高效價的多克隆腹水(anti-SID),在鱖魚Fry細胞進行的抗體阻斷實驗表明,在體外用抗體封閉SID-1蛋白的情況下,可提高ISKNV在細胞內(nèi)的病毒量,則從另一方面驗證了SID-1在宿主細胞抵抗病毒感染過程中的重要作用。
　　 NCBP2基因全長1088 bp,編碼164個氨基酸,具有一個RNA識別結(jié)構(gòu)域(RRM),符合核帽結(jié)合蛋白特征。氨基酸比對分析表明,NCBP2蛋白在進

8、化中較為保守,與所比對生物相似性均在70％以上。其基因組結(jié)構(gòu)全長5093bp,包括5個外顯子,4個內(nèi)含子。亞細胞定位表明,NCBP2轉(zhuǎn)染后在細胞內(nèi)彌散性表達,但在細胞中央呈明顯的集聚狀表達。NCBP2基因轉(zhuǎn)染FHM細胞后,通過G418篩選及單克隆化,建立了NCBP2穩(wěn)定表達細胞系。TFV感染穩(wěn)定表達NCBP2的FHM細胞后,通過觀察細胞病變、TFV病毒熒光實時定量PCR以及western blot分析,均表明穩(wěn)定表達NCBP2基因的細胞