鼻氣管鳥桿菌診斷方法的研究與應(yīng)用.pdf

1、鼻氣管鳥桿菌病(Ornithobacterium rhinotracheale,ORT)是由鼻氣管鳥桿菌引起的主要感染肉雞和火雞的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病,臨床上以呼吸道癥狀、生長障礙、死亡率增加為特征,病理上以嚴(yán)重的單側(cè)或雙側(cè)纖維素性化膿性肺炎、氣囊炎為特征。目前,該病在歐洲、美洲、南非的許多發(fā)達(dá)國家流行,并呈上升的趨勢,嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。我國已有分離到該病菌的報(bào)道,因此,應(yīng)引起人們的廣泛注意。本課題對鼻氣管鳥桿菌病的診斷

2、方法做了詳細(xì)的研究,成功建立了PCR、地高辛標(biāo)記探針、間接ELISA檢測方法,為ORT的診斷和流行病學(xué)調(diào)查奠定了基礎(chǔ),對預(yù)防和控制本病也具有重要意義。
　　 本研究內(nèi)容分為三部分:
　　 一、氣管鳥桿菌PCR診斷方法的建立與應(yīng)用
　　 根據(jù)GenBank已發(fā)表的鼻氣管鳥桿菌16S rRNA基因序列,設(shè)計(jì)1對可擴(kuò)增671bp目的片段的引物,建立了檢測ORT的PCR方法。該方法能在ORT參考菌株中擴(kuò)增到特異性片段,而

3、雞大腸桿菌、副雞嗜血桿菌、雞白痢沙門氏菌、禽多殺性巴氏桿菌的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；敏感性試驗(yàn)表明該方法最低檢出限量為90pg DNA。表明所建立的PCR方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。利用建立的方法對分離菌株進(jìn)行檢測,結(jié)果2株為陽性。
　　 二、地高辛標(biāo)記探針檢測鼻氣管鳥桿菌的建立與應(yīng)用
　　 利用PCR擴(kuò)增鼻氣管鳥桿菌16S rRNA基因的671bp的特異性片段,經(jīng)回收純化后用地高辛標(biāo)記,建立了地高辛標(biāo)記探針診斷ORT的

4、方法。特異性試驗(yàn)表明,地高辛探針可與ORT不同血清型參考菌株的核酸發(fā)生特異性雜交,而與雞大腸桿菌、副雞嗜血桿菌、雞白痢沙門氏菌、禽多殺性巴氏桿菌的核酸雜交均為陰性；敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,地高辛標(biāo)記探針對ORT的最低檢出量為100pg/μL；利用該探針對分離菌株進(jìn)行檢測,結(jié)果2株為陽性,利用該探針對211份疑似病料進(jìn)行檢測,結(jié)果4株為陽性,與PCR檢測結(jié)果一致。
　　 三、鼻氣管鳥桿菌間接ELISA檢測方法的建立及應(yīng)用
　　

5、 提取A型鼻氣管鳥桿菌(ORT)外膜蛋白,經(jīng)純化后包被反應(yīng)板,通過方陣滴定確定最佳抗原包被濃度、血清稀釋倍數(shù)、兔抗雞酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù),建立了檢測ORT抗體的間接ELISA方法。經(jīng)方陣滴定確定最佳抗原包被濃度為11.85μg/mL,血清樣品稀釋倍數(shù)為1:20,兔抗雞IgG辣根過氧化物酶結(jié)合物最佳稀釋倍數(shù)為1:1000,抗原抗體最佳結(jié)合時(shí)間為1h,血清與二抗最適反應(yīng)時(shí)間為45min。試驗(yàn)結(jié)果確定的判定標(biāo)準(zhǔn)為:樣品OD490nm≥0.639判