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1、1.根據(jù)已發(fā)表的IBRV的gD基因序列設(shè)計一對含有BamHⅠ，HindⅢ酶切位點引物，通過PCR方法擴增766bp的目的條帶gD，將gD基因克隆到原核表達載體pET32a，得到重組表達載體pET32-gD，將重組表達載體轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中，用IPTG誘導(dǎo)表達后，分子量約為53KDa的帶有6個His標(biāo)簽的融合蛋白得到高效表達。表達蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測，親和層析法純化，最后通過免疫印跡得到鑒定。 2.重組蛋白His-t
2、gD過柱純化后，作為抗原包被聚苯乙烯微量反應(yīng)板，初步建立檢測IBRV抗體的間接ELISA診斷方法。實驗結(jié)果表明：酶標(biāo)板的變異系數(shù)為7.3％，抗原的最適包被濃度為37.4μg/ml，血清最適稀釋度為1∶80；最適封閉液為1％BSA，封閉時間為37℃1h，最佳血清及二抗反應(yīng)時間確定為37℃1h和0.5h；底物顯色液的最佳反應(yīng)時間為15min；統(tǒng)計學(xué)分析后確定陰陽性的臨界值為0.5。用建立的ELISA方法檢測其它四種牛病的陽性血清均為陰性。證
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