牛傳染性鼻氣管炎阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)于1955年在美國首次發(fā)現(xiàn)。而Madin等人在第二年從病牛身上分離到牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectiousbovine rhinotraeheitis viruse，IBRV)。1964年牛鼻氣管炎病毒被Huck確認(rèn)屬于皰疹病毒，該病毒又稱牛1型皰疹病毒（Bovine herpesvirus-1，BHV-1），是皰疹病毒科α皰疹病毒亞科的成

2、員，它是一種有囊膜的雙股DNA病毒。
　　 牛傳染性鼻氣管炎是一種牛呼吸道接觸性傳染病，會(huì)引起鼻氣管炎、生殖道炎及母牛流產(chǎn)等。雖然牛傳染性鼻氣管炎不會(huì)造成很高的死亡率，但是感染該病毒后會(huì)造成潛伏感染和終生感染，當(dāng)機(jī)體的抵抗力降低時(shí)，病毒被重新激活，向體外排毒，使得該病極難根治，由此給養(yǎng)牛業(yè)帶來很大影響。
　　 該病從發(fā)現(xiàn)至今幾乎所有的國家均檢出IBR陽性，目前僅在澳大利亞、丹麥、芬蘭、挪威、瑞典、瑞士根除了該病。我國最早

3、是于20世紀(jì)70年代在進(jìn)口牛群中發(fā)現(xiàn)該病，之后一直在各地均檢出該病感染牛群。近幾年該病的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國牛群IBR平均感染率達(dá)到40％左右，而該病的防治措施主要是疫苗接種和病牛撲殺，所以建立有效的牛傳染性鼻氣管炎檢測(cè)方法十分必要。因此，本研究篩選出針對(duì)牛傳染性鼻氣管炎病毒的單克隆抗體，制備了辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上建立了牛傳染性鼻氣管炎阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法，并將該方法用于牛傳染性鼻氣管炎流行病學(xué)調(diào)

4、查中。主要工作包括:
　　 1.牛傳染性鼻氣管炎病毒單克隆抗體的制備
　　 以滅活的純化IBR病毒粒子作為免疫原，免疫Balb/c小鼠，五免后取免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，以間接ELISA方法篩選陽性融合細(xì)胞，經(jīng)過有限稀釋法克隆3次，獲得2株能穩(wěn)定分泌抗牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1H3、3G9。雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后接種Balb/c小鼠，收獲的2株腹水效價(jià)均達(dá)到1∶100×27，將單克隆抗

5、體與病毒粒子進(jìn)行免疫沉淀，所得免疫沉淀物進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)這2株單抗1H3、3G9分別針對(duì)IBRV的囊膜糖蛋白gB、gC。
　　 2.牛傳染性鼻氣管炎阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法的建立
　　 將純化的IBR病毒粒子滅活后，包被于96孔酶標(biāo)板，采用改良過碘酸鈉法將篩選的單克隆抗體1H3株標(biāo)記HRP，在此基礎(chǔ)上建立牛傳染性鼻氣管炎阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法。經(jīng)方陣ELISA方法確定抗原包被濃度為4μg/mL，被檢血清稀釋度為1

6、∶5，酶標(biāo)單克隆抗體稀釋度為1∶800。選取經(jīng)美國IDEXX傳染性牛鼻氣管炎病毒gE抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)為陽性的血清103份、檢測(cè)為陰性血清62份，采用本研究建立的阻斷ELISA方法檢測(cè)以上已知背景血清，結(jié)果顯示陽性符合率為96.12％，陰性符合率為100％，總符合率為97.57％。同時(shí)采用本方法檢測(cè)了牛5型皰疹病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛支原體、羊布魯氏菌、偽狂犬病毒、戊型肝炎病毒的陽性血清，結(jié)果顯示該方法除與牛5型皰疹病毒的陽性血清有交