針對gG基因的牛傳染性鼻氣管炎病毒新型檢測方法的建立和應(yīng)用.pdf

1、牛傳染性鼻氣管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis,IBR)是牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious Bovine Rrhinotracheitis viruses,IBRV)引起的牛的一種以上呼吸道炎癥為主的,急性、熱性、接觸性傳染病,臨床表現(xiàn)以鼻氣管炎、眼結(jié)膜炎、高熱、流產(chǎn)、傳染性膿皰為主要特征。本課題組前期研究建立了gG缺失的IBRV標(biāo)記疫苗株,因此,本研究旨在建立配套的鑒別診斷方法。以奶牛I

2、BRV-gG為靶基因設(shè)計(jì)引物,建立PCR鑒別檢測方法；截短克隆表達(dá)和純化了奶牛IBRV-gG基因,制備了IBRV-gG單克隆抗體與多克隆抗體,建立了檢測牛IBRV-gG的雙抗體夾心ELISA方法,同時對一株IBRV-gG單克隆抗體進(jìn)行辣根過氧化物酶標(biāo)記,建立了檢測奶牛IBRV-gG的競爭ELISA方法。論文的主要結(jié)果如下:
　　 1.牛傳染性鼻氣管炎病毒PCR檢測方法的建立
　　 根據(jù)基因庫中牛傳染性鼻氣管炎病毒的gG基

3、因設(shè)計(jì)特異性引物,建立了一種PCR技術(shù),可快速檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒(bovine infectious rhinotracheitis virus,IBRV),又可同時區(qū)分同屬病毒牛皰疹病毒5型和偽狂犬病毒。
　　 2.牛傳染性鼻氣管炎病毒gG蛋白基因的截短表達(dá)
　　 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的IBRV gG基因序列(GenBank登錄號:NC_001847.1),利用計(jì)算機(jī)軟件輔助篩選出gG抗原性強(qiáng)且不含疏水區(qū)和

4、信號肽的區(qū)域,并用DNAstar軟件設(shè)計(jì)1對特異性引物,以牛傳染性鼻氣管炎病毒基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增gG基因,克隆到T載體pMD18-T,通過酶切分析及測定序列鑒定正確后,亞克隆至原核表達(dá)載體pET-32a。
　　 3.抗牛傳染性鼻氣管炎病毒gG蛋白單克隆抗體及多克隆抗體的制備
　　 用純化的IBRV和IBRV-gG重組蛋白為免疫原,免疫Balb/c小鼠,取脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,用純化的表達(dá)蛋白、IB

5、RV野毒株和缺失IBRV-ΔgG分別包被酶標(biāo)板進(jìn)行間接ELISA法篩選,經(jīng)間接ELISA方法篩選和有限稀釋法三次克隆獲得分泌抗IBRV野毒株的單克隆抗體(McAb)的雜交瘤細(xì)胞。Western-blot試驗(yàn)證明此單抗能特異性地與IBRV反應(yīng),與gG缺失IBRV-ΔgG不反應(yīng),用小鼠腹水生產(chǎn)的McAb的ELISA效價為1:51200。此單克隆抗體可以用于IBRV的鑒別檢測,為我國牛傳染性鼻氣管炎控制計(jì)劃的實(shí)施提供了工具。
　　 4

6、.牛傳染性鼻氣管炎IBRV-gG檢測夾心ELISA方法的建立
　　 將純化的牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)免疫BALB/c小鼠,分離免疫小鼠的脾細(xì)胞,與SP2/0細(xì)胞融合,經(jīng)間接ELISA篩選,得到了3D6,1E8和1F4三株可以穩(wěn)定分泌抗IBRV-gG特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株,用純化的IBRV免疫新西蘭大白兔,按常規(guī)方法制備IBRV多抗。選用抗gG單抗3D6株包被ELISA板,用兔抗IBRV多抗作為捕獲抗體,建立了IBRV雙

7、抗體夾心ELISA檢測方法。用該ELISA方法分別檢測IBRV、牛分支桿菌、牛支原體、牛病毒性腹瀉病毒、牛合胞體病毒、牛副流感病毒3型。結(jié)果表明,該ELISA方法具有良好的特異性。
　　 5.牛傳染性鼻氣管炎病毒IBRV-gG抗體檢測競爭ELISA方法的建立
　　 用牛傳染性鼻氣管炎病毒gG基因片段原核表達(dá)產(chǎn)物免疫小鼠制備單抗,并利用表達(dá)蛋白和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的單抗3D6建立了競爭ELISA,旨在檢測IBRV