鈍頂螺旋藻-節(jié)旋藻藻藍(lán)蛋白的提取純化及抗腫瘤免疫效應(yīng)研究.pdf

1、從海洋生物中尋找高效、低毒副作用的抗腫瘤藥物是近年天然藥物研究的新領(lǐng)域。近年來(lái)，隨著海洋生物藥學(xué)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)許多海洋生物尤其許多藻類，其體內(nèi)含有各種特有藥物功能。其中鈍頂螺旋藻(Spirulina ptatensis,又稱鈍頂節(jié)旋藻Arthrospira platensis)中的藻藍(lán)蛋白(C-phycocyanin，CPC)以其特有的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值受到廣泛的重視。因其水溶性、無(wú)毒、清亮且著色力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，CPC被廣泛用于食品著

2、色劑和化妝品的添加劑。帶有熒光，可用作熒光標(biāo)記物。另有研究表明藻藍(lán)蛋白具有抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抗病毒、增強(qiáng)免疫力、清除自由基和保肝、降血脂等生理活性，這為螺旋藻在功能性食品和藥品領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)提供重要的決策依據(jù)。目前有關(guān)藻藍(lán)蛋白抗腫瘤免疫機(jī)理的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少，本課題研究的主要目的旨在揭示藻藍(lán)蛋白發(fā)揮作用的深層機(jī)理，以期更深層次的發(fā)揮其應(yīng)用價(jià)值。 首先對(duì)鈍頂螺旋藻中藻藍(lán)蛋白的提取和純化方法進(jìn)行了改進(jìn)。采用磷酸鹽緩沖液循環(huán)凍融聯(lián)

3、合超生波破碎法，50％硫酸銨沉淀獲得CPC，提取率達(dá)到13.1％。粗蛋白提取液再經(jīng)過(guò)兩次羥基磷灰石柱(HA)層析和sephacrylS-200HR凝膠層析對(duì)其進(jìn)行純化，純度達(dá)到4.71％。純化后的CPC在12％SDS-PAGE中得到兩條帶，分別是α和β兩個(gè)亞基，分子量分別為21.4ku和17.0ku。結(jié)果表明，通過(guò)上述分離純化過(guò)程得到了較高提取率和電泳純度的CPC。 然后我們對(duì)CPC的抗腫瘤免疫活性進(jìn)行了研究。主要包括5個(gè)方面：

4、①cpc的體外抑瘤作用研究：檢測(cè)CPC對(duì)人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、乳腺癌細(xì)胞(MCF)、胃癌細(xì)胞(NKM)、卵巢癌細(xì)胞(SVOA)、人胚肺細(xì)胞(HEL)體外生長(zhǎng)的影響。在體外培養(yǎng)條件下用不同濃度的CPC(終濃度為20，40，80，160μg/ml)處理這4種癌細(xì)胞和1株正常細(xì)胞，運(yùn)用MTT法檢測(cè)CPC對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯不CPC對(duì)這4種癌細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，并存在濃度劑量效應(yīng)，高濃度抑制作用強(qiáng)，但對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯影響。②CP

5、C誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的分子免疫機(jī)理探討：通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CPC對(duì)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期變化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰(GO-Gl)；電鏡檢測(cè)細(xì)胞的凋亡形態(tài)；瓊脂糖凝膠電泳觀察凋亡細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果顯示DNA發(fā)生片段化，呈現(xiàn)梯狀；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CPC對(duì)細(xì)胞表面凋亡相關(guān)蛋白(Fas、ICAM-1、Bc1-2)表達(dá)的影響,結(jié)果表明CPC可促進(jìn)促凋亡基因Fas、ICAM-1的表達(dá)同時(shí)抑制抗凋亡基因Bc1-2的表達(dá);檢測(cè)還

6、發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞的caspase酶的活性增強(qiáng)且細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素c由線粒體向胞漿的釋放。通過(guò)上述試驗(yàn)檢測(cè)CPC對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響,從而揭示了CPC誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的作用機(jī)理。③CPC的體內(nèi)抗腫瘤免疫活性研究:建立S180荷瘤小鼠動(dòng)物模型,腹腔注射CPC,11天后通過(guò)QHS、ELISA、MTT等試驗(yàn)從免疫器官、免疫細(xì)胞、免疫分子水平上檢測(cè)CPC的抗腫瘤免疫效應(yīng)。結(jié)果顯示,CPC組小鼠瘤塊直徑及瘤體重量均小于對(duì)照組,T細(xì)胞及B

7、細(xì)胞活性明顯增強(qiáng),體液抗體量顯著提高,CPC高劑量組比低劑量組抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和提高機(jī)體免疫力的作用更明顯。從而揭示藻藍(lán)蛋白的抗腫瘤作用與機(jī)體免疫系統(tǒng)免疫功能的增強(qiáng)有關(guān)。④探討CPC對(duì)HeLa細(xì)胞CD59基因表達(dá)的調(diào)控作用。以正常人CD59cDNA為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增后重組入真核表達(dá)質(zhì)粒載體pALTER-MAX,然后利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體(Lipfectamine-2000)將重組質(zhì)粒和PeDNA共轉(zhuǎn)染HeLa和對(duì)照用正常中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(C

8、hinese hamster ovary,CHO)進(jìn)行表達(dá)。用不同濃度的CPC作用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞,通過(guò)核酸分子雜交技術(shù)、免疫熒光標(biāo)記法和ELISA法對(duì)細(xì)胞中CD59分子的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明:成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pALTER-MAX-CD59,并將其導(dǎo)入真核細(xì)胞(HeLa,CHO),經(jīng)G418篩選獲得了CD59分子高效表達(dá)的細(xì)胞克隆。用CPC作用于篩選出的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,證實(shí)CPC可促進(jìn)HeLa細(xì)胞表面CD59蛋白和Fas蛋白的表達(dá)、并抑制He

9、La細(xì)胞的增殖,而對(duì)于正常CHO細(xì)胞無(wú)明顯作用,從而提示CD59可能參與CPC的抑癌作用。⑤CPC介導(dǎo)的光動(dòng)力學(xué)療法用于宮頸癌的治療:本研究是通過(guò)建立HeLa荷瘤小鼠動(dòng)物模型,脾區(qū)注射藻藍(lán)蛋白后,經(jīng)He-Ne激光輻照瘤體13天后,取胸腺、脾臟檢測(cè)NK細(xì)胞活性并采用MTT法檢測(cè)免疫細(xì)胞增殖活性。取瘤塊制成石蠟包埋切片,采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)P53、NFκB、Fas、CD44基因的表達(dá),以期判定藻藍(lán)蛋白是否具有光敏作用及可否作為