鵝TLR7和TLR21的分子克隆、生物信息學(xué)分析及其免疫學(xué)特性研究.pdf

1、Toll樣受體是機(jī)體內(nèi)一類重要的病原識別受體，能對入侵機(jī)體的病原微生物進(jìn)行及時的識別，從而啟動機(jī)體固有免疫應(yīng)答并影響適應(yīng)性免疫的產(chǎn)生。本研究首次克隆并報道了四川白鵝Toll樣受體家族的TLR7和TLR21的cDNA序列，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。鵝TLR7包含一個完整的開放閱讀框，編碼1045個氨基酸，其信號肽位于第1到27位，跨膜區(qū)位于第836位到860位，高度保守TIR結(jié)構(gòu)域位于第884位到1034位。鵝TLR21包含一個完整的開放閱

2、讀框，編碼975個氨基酸，其信號肽位于第1到35位，跨膜區(qū)位于第757位到779位，高度保守TIR結(jié)構(gòu)域位于第809位到951位。比較兩基因在不同物種之間蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)物種之間親緣關(guān)系越接近比對相似性越高。
　　為了得到TLR7和TLR21在鵝體各個組織的分布情況，我們利用半定量RT-PCR和定量RT-PCR方法構(gòu)建了組織表達(dá)譜。整個實(shí)驗(yàn)過程中，選擇β-actin和GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果校正檢測。我們發(fā)現(xiàn):

3、TLR7的轉(zhuǎn)錄水平在雛鵝的法氏囊上最高，且在與免疫功能相關(guān)的組織如盲腸，哈德氏腺等也相對較高。值得注意的是，肺臟的相對表達(dá)量僅次于法氏囊，說明鵝TLR7與呼吸道疾病或許有緊密聯(lián)系。比較不同年齡鵝之間免疫組織表達(dá)譜后，我們發(fā)現(xiàn)無論是成年鵝，還是幼鵝，都在法氏囊和脾臟有穩(wěn)定的高表達(dá)。不同的是，幼鵝以法氏囊，胸腺為主要免疫器官，而或許是隨著發(fā)育進(jìn)行，成年鵝則是以外周血，法氏囊和脾臟為主要免疫器官。TLR21的轉(zhuǎn)錄水平在鵝的哈德氏腺，胸腺等免疫

4、功能相關(guān)組織表達(dá)量高。比較不同年齡鵝之間全組織表達(dá)譜后，我們發(fā)現(xiàn)幼年鵝法氏囊表達(dá)最高，而成年鵝法氏囊卻只有中等的轉(zhuǎn)錄水平，這與TLR7的結(jié)果類似，說明鵝免疫分子的在組織中的表達(dá)量隨個體生長發(fā)育而有所變化。總體來講，TLR7和TLR21都在免疫組織器官中高表達(dá)，這與它們發(fā)揮的免疫功能密切相關(guān)。不同發(fā)育階段鵝TLRs的組織表達(dá)差異，也說明了鵝免疫系統(tǒng)隨著發(fā)育而成熟。
　　為了驗(yàn)證鵝TLR7和TLR21的免疫學(xué)特性，我們選取了幾種免疫刺

5、激劑:R848、Imiquimod、Poly(I∶C)和ODN2006。這些刺激劑都是已知證實(shí)能被Toll樣受體識別，并引發(fā)固有免疫反應(yīng)。其中R848是TLR7和TLR8的刺激劑，Imiquimod是TLR7的刺激劑，Poly(I∶C)是TLR3的刺激劑，而ODN2006則是TLR9和TLR21的刺激劑。通過這些刺激劑處理分離的鵝脾臟淋巴細(xì)胞和鵝外周血淋巴細(xì)胞，利用定量RT-PCR方法檢測TLR7和TLR21是否受刺激而表達(dá)上調(diào)，同時檢

6、測免疫通路下游的促炎性因子IL-6，IL-1β和干擾素IFN-α與IFN-γ的表達(dá)情況。整個實(shí)驗(yàn)過程中，選擇β-actin和GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果校正檢測，并同時以PBS處理鵝脾臟淋巴細(xì)胞和鵝外周血淋巴細(xì)胞做陰性對照。我們發(fā)現(xiàn):和預(yù)期一樣，R848和Imiquimod都能引起鵝TLR7的響應(yīng)，同時TLR7介導(dǎo)固有免疫通路下游的IL-6，IL-1β和IFN-α也都有顯著的表達(dá)上調(diào)。ODN2006能夠有效的刺激鵝TLR21的表達(dá)并

7、引發(fā)下游的IL-6，IL-1β，IFN-α和IFN-γ的顯著上調(diào)，而Poly(I∶C)作為陽性對照，對TLR7和TLR21表達(dá)量無影響，但是上調(diào)IL-6和IFN-α的表達(dá)，說明或許是鵝TLR3被刺激產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。總體來說，這些刺激劑都能有效地引起鵝脾臟淋巴細(xì)胞和鵝外周血淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)，因此有作為新型鵝疾病防治免疫佐劑的可能。
　　為了確認(rèn)鵝TLR7和TLR21參與宿主的抗病毒反應(yīng)，我們選用新型雛鵝病毒性腸炎病毒(NGVEV)

8、感染分離的鵝脾臟淋巴細(xì)胞和鵝外周血淋巴細(xì)胞，利用定量RT-PCR方法檢測TLR7和TLR21是否受刺激表達(dá)上調(diào)，同時檢測免疫通路下游的促炎性因子IL-6，IL-1β和干擾素IFN-α與IFN-γ的表達(dá)情況。整個實(shí)驗(yàn)過程中，選擇β-actin和GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果校正檢測，并同時以PBS處理鵝脾臟淋巴細(xì)胞和鵝外周血淋巴細(xì)胞做陰性對照。我們發(fā)現(xiàn):在NGVEV感染之后，鵝TLR7在96h內(nèi)均無表達(dá)上調(diào)，而鵝TLR21則能被刺激，并