白藜蘆醇對糖尿病小鼠腎臟氧化應(yīng)激操作的保護(hù)作用.pdf

1、目的:糖尿病腎病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一。近年來，DN的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，已成為終末期腎病(endstagerenaldisease，ESRD)的主要原因之一。因此，明確DN的發(fā)病機(jī)制及有效的防治措施是如今備受關(guān)注的研究熱點(diǎn)。大量研究證明在DN病因?qū)W中，氧化應(yīng)激(oxidativestress，OS)是主要的病生機(jī)制。高血糖造成腎臟活性氧簇(reactiveoxygenspe

2、cies，ROS)生成增加，過度增加的ROS會激活多種與血管并發(fā)癥相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，造成細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)增多，加速腎臟纖維化進(jìn)展。
　　 機(jī)體在應(yīng)對ROS損害時形成一套復(fù)雜的氧化應(yīng)激應(yīng)答系統(tǒng)，自身會誘導(dǎo)出一系列保護(hù)性蛋白，以減輕細(xì)胞發(fā)生的氧化應(yīng)激損傷。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(NuclearfactorE2-relatedfactor2，Nrf2)和它的胞質(zhì)接頭蛋白(KelchlikeECH

3、associatedprotein1，Keap1)是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的中樞調(diào)節(jié)者。Nrf2是外源性有毒物質(zhì)和氧化應(yīng)激的感受器，通過與抗氧化應(yīng)激反應(yīng)元件(antioxidativeresponseelement，ARE)相互作用，誘導(dǎo)編碼抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，如血紅素氧合酶1(hemeoxygenase，HO-1)即是其中重要的抗氧化酶，從而在細(xì)胞的防御保護(hù)中發(fā)揮作用。
　　 白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種

4、多酚類植物抗毒素，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、保肝、抗過敏、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂、神經(jīng)保護(hù)等多種生物學(xué)作用。近年來研究表明，白藜蘆醇可能通過減少氧化應(yīng)激對糖尿病腎病發(fā)揮保護(hù)作用，然而白藜蘆醇的抗氧化應(yīng)激機(jī)制及其對Nrf2-ARE途徑的作用，目前國內(nèi)外研究還較少。
　　 本課題通過單側(cè)腎切除和注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)建立1型糖尿病小鼠模型，并在不同的時間點(diǎn)給予白藜蘆醇灌胃進(jìn)行干預(yù)，采用硫代巴比妥酸法(TBA法)

5、測定腎組織勻漿丙二醛(MDA)的含量，黃嘌呤氧化酶法測定總超氧化物歧化酶(T-SOD)的活力，并用免疫組化和Westernblot兩種檢測方法，測定糖尿病小鼠腎皮質(zhì)中的Nrf2及抗氧化酶HO-1的表達(dá)變化，從而探討白藜蘆醇對糖尿病小鼠模型腎臟保護(hù)的作用機(jī)理，為DN尋找防治方法提供實(shí)驗(yàn)性理論依據(jù)。
　　 方法:選擇清潔級健康雄性CD-1小鼠72只，右腎切除后2周隨機(jī)抽取36只按130mg/Kg腹腔注射STZ(溶于0.1mol/L枸

6、櫞酸緩沖液中，PH為4.5)制備糖尿病小鼠模型。剩余36只僅注射等體積的枸櫞酸緩沖液。72小時后尾尖取血測定血糖，留尿測尿糖，以血糖≥16.7mmol/L、尿糖（+++）～(++++)作為糖尿病模型成功的標(biāo)準(zhǔn)。糖尿病模型組隨機(jī)分為糖尿病模型組(DM組)和白藜蘆醇干預(yù)組(DR組);非糖尿病模型組隨機(jī)分為正常對照組(CN組)和白藜蘆醇對照組(CR組)。CR組與DR組給予白藜蘆醇混懸液5mg·kg-1·d-1灌胃，CN組與DM組給予等體積的溶

7、劑（羧甲基纖維素）。分別于成模后的4、8、12周末，測定各組小鼠的體重，用代謝籠收集24小時尿，測定24小時尿蛋白排泄率;股動脈取血，分離血清，測定血肌酐、尿素氮;切取腎臟，稱量腎重，留取腎組織，用免疫組化染色檢測Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)情況，用Westernblot檢測Nrf2核蛋白和總蛋白及HO-1的表達(dá)水平，并測定MDA含量和T-SOD的活力。數(shù)據(jù)均以(x±s)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

8、>　　 結(jié)果:
　　 1.腎指數(shù):DM組較CN組在3個時間點(diǎn)均出現(xiàn)明顯增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;與DM組相比，4周時DR組有所降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），8、12周時降低更明顯，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.生化指標(biāo):在4、8、12周末時，CN、CR組間的24小時尿蛋白定量、血肌酐及尿素氮無明顯差異(P＞0.05），DM組較同期CN組均顯著增高（P＜0.01），而DR組各

9、指標(biāo)較DM組出現(xiàn)明顯下降（P＜0.05），但較同期的CN組相比有所增高（P＜0.05）。
　　 3.丙二醛的含量:各個時間點(diǎn)，CN與CR組之間無顯著性差異（P＞0.05)，DM組較CN組明顯升高（P＜0.01），DR組與DM組相比明顯降低（P＜0.05），但仍高于CN組（P＜0.05）
　　 4.總超氧化物歧化酶的活力:各個時間點(diǎn)，CN與CR組之間無顯著性差異（P＞0.05），DM組較CN組明顯降低（P＜0.01），8周

10、、12周時DR組與DM組相比明顯增加（P＜0.05），但仍低于CN組(P＜0.05)。
　　 5.免疫組織化學(xué)染色和Western印跡:4周、8周、12周，同期的CN與CR組HO-1蛋白、Nrf2總蛋白及核蛋白的表達(dá)均無明顯差異(P＞0.05），DM組Nrf2總體和在核中的表達(dá)均高于CN組(P＜0.01），DR組的表達(dá)較DM組進(jìn)一步升高(P＜0.01)。4周時DM組HO-1的表達(dá)較CN組是減少的(P＜0.01)，但8、12周時是