rai16蛋白合成肽多克隆抗體的制備及初步應用

1、<p>　　RAI16蛋白合成肽多克隆抗體的制備及初步應用</p><p>　　作者：雒喜忠, 王閣, 許文, 李瓊, 陳川, 張志敏, 胡慶, 王東</p><p>　　【摘要】 目的: 制備RAI16蛋白的合成肽多克隆抗體, 并進行初步鑒定和應用, 為研究RAI16蛋白的功能及作用機制獲得重要的實驗工具。方法: 應用Fmoc法化學合成RAI16蛋白N端第44～55位氨基酸的

2、多肽, 經(jīng)C18的RPHPLC純化后, 通過高碘酸鈉法將純化的RAI16蛋白的多肽與KLH交聯(lián); 皮下注射抗原免疫新西蘭純種大耳白兔, 加強免疫得到抗血清, 應用蛋白G純化獲得多克隆抗體。對純化的抗體進行ELISA、 免疫組化、 Western blot等初步鑒定和應用。結(jié)果: 化學合成RAI16蛋白N端第44～55位氨基酸的多肽, 純化后多肽純度為96％ , 達到免疫用抗原標準。多肽與KLH交聯(lián), 用于免疫動物。經(jīng)純化后的抗體效價為

3、1∶125 000。該多肽抗體可特異識別人脾臟組織中相對分子質(zhì)量(Mr)約為55 000的RAI16蛋白。結(jié)論: 所制備的多克隆抗體能與天然RAI16蛋白發(fā)生特異性反應, 可應用于ELISA、 免疫組化、 免疫沉淀和Western blot等實驗, 為確定RAI16蛋白的組織分布和亞細胞定位、 研究RAI16蛋白的功能及作用機制提供了重要的實驗工具</p><p>　　【關鍵詞】 視黃酸誘導蛋白16; 多肽抗原

4、; 多克隆抗體; ELISA; 親和層析</p><p>　　近幾年在對視黃酸（RA）作用研究中發(fā)現(xiàn)了視黃酸誘導蛋白（RAI）系列基因, 但尚無具體完整的結(jié)構(gòu)和功能研究的相關報道, 只是推測RAI 系列蛋白可能是一種“新型”的胞內(nèi)參與信號轉(zhuǎn)導轉(zhuǎn)錄調(diào)控的蛋白質(zhì)家族。視黃酸誘導蛋白16（RAI16）蛋白作為家族成員之一, 了解其結(jié)構(gòu)功能, 對認識整個家族特征具有重要的意義。</p><p&

5、gt;　　我們前期工作以Tec激酶結(jié)構(gòu)域作為“釣餌”蛋白, 利用酵母雙雜交技術篩選構(gòu)建于轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)載體的人胎肝cDNA文庫, 經(jīng)營養(yǎng)缺陷選擇及誘導篩選及初步鑒定, 發(fā)現(xiàn)并確證了一個新的陽性克隆, 對篩庫所得基因片段測序經(jīng)BLAST比對分析后, 確定為RAI16(Homo sapiens retinoic acid induced 16)基因, 已被GenBank收錄(編號為BC052237), 組織來源為腦Ⅳ型星狀細胞瘤,

6、其編碼蛋白為RAI16。并由此推譯出其蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu), 對其功能區(qū)、 信號肽、 亞細胞定位、 二級結(jié)構(gòu)及親疏水性等進行了分析。研究表明, RAI16蛋白是一種定位于胞質(zhì)內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的分泌型的球形信號蛋白, RAI16蛋白很可能在肝干細胞和肝癌誘導分化過程中, 作為RA誘導蛋白被信號蛋白分子募集至胞質(zhì)內(nèi), 通過磷酸化、 去磷酸化、 豆蔻?；?、 酰胺化等修飾, 通過不同的活化形式和剪切方式以及胞質(zhì)與胞核間的移位, 完成其在信號轉(zhuǎn)導中的重要角色

7、［1］。因此推測RAI16蛋白可能為RA信號通路中一類胞質(zhì)內(nèi)重要“新”的信號蛋白分子。結(jié)合前期工作, 根據(jù)人RAI16蛋白的cDN</p><p><b>　　1 材料和方法</b></p><p>　　1.1 材料 免疫和篩選用的RAI16蛋白cDNA編碼的氨基酸序列N端第44～55位氨基酸的多肽為化學合成, 免疫用抗原C端交聯(lián)載體蛋白鑰孔戚血藍素(KLH)

8、, 均由上海艾比瑪特公司采用合成肽自動合成儀合成。Methylated bovine serum albumin(MBS)和福氏佐劑為Sigma公司產(chǎn)品。HiTrapTM Protein G HP抗體純化柱為Amersham公司產(chǎn)品。羊抗兔IgGHRP和 DAB為北京中杉金橋生物技術公司產(chǎn)品。ECL反應試劑盒為Amersham公司產(chǎn)品。SephadexTMG25 脫鹽柱(Amersham Biosciences, Sweden)、

9、小牛血清、 牛血清白蛋白、 loading buffer為TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品; 免疫用兔子系新西蘭純種白兔2只（1.5個月左右, 雄性健壯, 質(zhì)量為2 000～ 2 200 g）, 由上海申旺實驗動物中心提供。</p><p><b>　　1．2 方法</b></p><p>　　1.2.1 RAI16合成肽的設計 結(jié)合前期的研究,

10、從GenBank中檢索到RAI16蛋白cDNA全長序列, 利用DNAstar軟件根據(jù)抗原指數(shù)(Antigenic Index)、 親水性結(jié)構(gòu)(Hydrophilicity Plot)、 柔韌區(qū)(Flexible Regions)及表面概率結(jié)構(gòu)(Surface Probability Plot) 4個參數(shù)及特異性、 合成難易程度等方面綜合分析RAI16序列的特點, 確定氨基酸片段為欲合成的肽序列, 從N端起包含第44～55位氨基酸, 其序

11、列為: CSTPAKKTDIPWRNH2。</p><p>　　1.2.2 RAI16蛋白N端多肽抗原的合成及其與KLH 和BSA 的交聯(lián) RAI16合成肽由上海艾比瑪特公司采用合成肽自動合成儀合成?；瘜W合成采用Fmoc方法, 從C端向N端合成, 獲得的多肽經(jīng)常規(guī)C18的RPHPLC柱進行純化。純度為96%。RAI16與KLH和BSA的交聯(lián)采用戊二醛連接法, 將5 mg合成肽加入7 mg KLH和BSA

12、中, 邊振蕩邊緩慢加入新鮮配制的3 g/L 的戊二醛溶液 (1 mL), 室溫作用2 h。以pH8.5硼酸緩沖液透析過夜, 交聯(lián)形成RAI16KLH、 RAI16BSA偶聯(lián)物。</p><p>　　1.2.3 RAI16蛋白合成肽抗體的制備 取200 μg合成肽KLH偶聯(lián)物與等量的完全福氏佐劑充分乳化后, 于兔頸部和背部皮下多點注射, 每點約100 μg。4周后加強免疫, 劑量同前, 用不完全福氏佐劑充

13、分乳化后, 于兔背部皮下多點注射; 以后隔2周加強免疫1次; 從第3次加強免疫開始, 每次免疫后7 d, 經(jīng)耳中央動脈采血測定抗體的效價, 經(jīng)過4次加強免疫后符合要求時, 立即頸動脈采血, 分離血清后, 無菌分裝保存于-80℃?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　1.2.4 ELISA檢測抗血清效價 用人脾臟微粒體蛋白和合成肽BSA偶聯(lián)物以1 mg/L 的濃度包被ELISA檢測板, 每孔100 μL, 4℃孵育過

14、夜后, 用10 mL/L胎牛血清封閉, 37℃ 2 h后, 洗滌備用。取出包被好的檢測板, 每孔加入按1∶2梯度稀釋的抗血清100 μL (對照為正常兔血清), 37℃孵育30 min, 洗滌3次后每孔加入1∶5 000稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG 100 μL, 37℃孵育30 min, 洗滌3次后進行TMB顯色, 37℃孵育15 min, 中止反應后, 用酶標儀測定樣品的A450的吸光值。</p><p>

15、;　　1.2.5 抗體血清的親和純化 將獲得的兔抗人RAI16多肽的抗體血清用結(jié)合緩沖液(100 mmol/L Tris/HC1, pH7.5, 100 mmol/L NaC1)稀釋后, 經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾, 加樣到HiTrapTM ProteinG HP的純化柱上, 用洗脫緩沖液(100 mmol/L甘氨酸HCL, pH2.5)洗脫后, 收集洗脫峰。</p><p>　　1.2.6 間接ELIS

16、A檢測抗體相對親和常數(shù) 用合成肽交聯(lián)BSA以1.5 mg/L和1.0 mg/L的濃度包被ELISA檢測板, 封閉后加入倍比稀釋的已知蛋白濃度的純化后的抗體, 再加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗, TMB顯色測定A450。以抗體濃度的對數(shù)為橫坐標, A450值為縱坐標作圖。以曲線達到水平時的A值為100%, 求出A50即50% A值對應的抗體濃度。按照Kaff=(n-1)/2(n［Ab’］ t - 2 ［Ab ］ t) 算出抗體親和常數(shù)

17、, 其中［Ab’］ t 、 ［Ab ］ t指的是A50時即包被抗原為1.5 mg/L和1.0 mg/L時抗體半飽和時抗體的摩爾濃度, ［Ag］ t、 ［Ag’］ t指的是包被的抗原濃度本實驗中即指15 μg和10 μg, n=［Ag］t/［Ag’］t, 本實驗中n=2。</p><p>　　1.2.7 多克隆抗體的Western blot分析 用RIPA裂解液(10 mL/L NP40, 150 mmo

18、l/L NaCl, PBS pH7.2, 2 mmol/L EDTA, 50 mmol/L氟化鈉, 0.2 mmol/L礬酸鈉, 蛋白酶抑制劑1∶50)裂解冰凍人脾臟組織樣品, 冰上孵育30 min后, 13 500 g離心45 min, 獲得脾臟組織總蛋白, 取5 g總蛋白裂解液并加入等體積2×SDS加樣緩沖液, 于100℃加熱5 min后, 進行常規(guī)SDSPAGE電泳, 分離膠濃度為100 g/L。電泳結(jié)束后, 電轉(zhuǎn)至

19、PVDF膜上, 用50 g/L脫脂奶粉室溫下封閉1 h; 然后加入1∶1 000稀釋的兔抗人RAI16蛋白N端多肽多抗, 室溫下孵育2 h, TBST緩沖液洗膜后, 加入羊抗兔IgGHRP抗體(1∶5 000稀釋), 室溫下孵育1 h, TBST緩沖液洗膜后, ECL法顯色。</p><p>　　1.2.8 RAI16在再生肝組織中表達的Western blot分析 組織蛋白提取按申能博彩RIPA使用說明書

20、操作（同時增加5 mmol/L benzamidine, 1 μmol/L aprotinin A, 1 μmol/L pepstatin, 1 μmol/L leupeptin, 1 mmol/L PMSF, pH7.4）, 上清進行冷凍干燥24 h, 用含蛋白酶抑制劑的PBS 60 μL稀釋蛋白沉淀; 對獲得肝組織蛋白進行考馬斯亮藍法定量, 調(diào)整密度為6 g/L, 樣品容積與載樣緩沖液等量混合, 實際濃度為3 g/L。樣品15 μL

21、/lane, 100℃, 煮沸5 min、 迅速冷卻, 短暫離心; 生物素標記Marker , 10 μL+10 μL載樣緩沖液/lane , 100℃, 煮沸2 min、 迅速冷卻, 短暫離心。按生物素標記Marker、 正常對照組、 肝切除術后0.5 h、 1 h、 2 h、 4 h、 8 h、 24 h、 48 h、 72 h的順序加樣后, 進行常規(guī)SDSPAGE電泳, 分離膠濃度為110 g/L。電泳結(jié)束后, 電轉(zhuǎn)至PVDF

22、膜上</p><p>　　1.2.9 多克隆抗體的免疫組化染色 取出用丙酮固定的石蠟包埋的大鼠再生臟組織切片, 滴加50 g/L BSA, 室溫下封閉20 min, 加入1∶1 000稀釋RAI16多肽抗體, 4℃孵育過夜。PBS洗片后加入羊抗兔IgG2HRP, 37℃孵育20 min, PBS洗片后進行DAB顯色, 蘇木素復染, 返藍后, 脫水、 透明、 封片, 鏡檢, 放大400倍拍照

23、記錄結(jié)果。</p><p><b>　　2 結(jié)果</b></p><p>　　2.1 RAI16的氨基酸序列分析 用DNAstar軟件根據(jù)親水性結(jié)構(gòu)、 柔韌區(qū)、 抗原指數(shù)及表面概率結(jié)構(gòu)4個參數(shù)對氨基酸序列進行綜合分析(圖1) 。預測的結(jié)果進行綜合考慮, 選取欲合成的肽序列為第44～55位氨基酸(圖中陰影區(qū)), 其序列為: CSTPAKKTDIPWRNH2。

24、</p><p>　　2.2 RAI16蛋白多肽抗原的合成與純化 化學合成的多肽經(jīng)HPLC純化后, 純度可達96％, 交聯(lián)KLH后可作為抗原免疫動物。</p><p>　　2.3 抗血清的特性鑒定 ①效價測定: 合成多肽經(jīng)4次動物免疫并進行效價測定確定抗體產(chǎn)生后, 收集兔抗血清, 蛋白G純化后, 經(jīng)間接ELISA檢測, 效價約為1∶125 000。②相對親和力常數(shù)測定(圖2):

25、 用間接ELISA測定純化后抗體的親和常數(shù)10-5～10-6 M-1。</p><p>　　2.4 RAI16合成肽多克隆抗體的Western blot分析 由于RAI16在脾臟組織表達豐度較肝組織顯著, 因此選取脾臟組織并將其裂解后獲取的總蛋白作為電泳樣本, 對純化的兔抗人RAI16合成肽多克隆抗體進行Western blot分析, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)RAI16合成肽的多克隆抗體可特異性識別脾臟組織中相對分子質(zhì)量(M

26、r)約為55 000的蛋白(抗原) (圖3)。</p><p>　　2.5 RAI16在再生肝組織中表達的Western blot分析 由于在酵母雙雜交系統(tǒng)篩選中Tec酪氨酸激酶與RAI16蛋白相互作用的現(xiàn)象, Tec本身與肝癌細胞、 肝干細胞和肝細胞的關系密切, Tec是肝干細胞和肝細胞增殖、 定向誘導分化及凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑中關鍵的蛋白激酶連接分子［1］, Tec在肝再生過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用［2］。因此

27、, 將正常肝組織、 0.5 h、 1 h、 2 h、 4 h、 8 h、 24 h、 48 h、 72 h鼠再生肝組織分別裂解后獲取的總蛋白作為電泳樣本, 用制備的兔抗人RAI16合成肽的多克隆抗體為一抗, 以羊抗兔HRPIgG、 羊抗鼠HRPIgG為二抗, , 以小鼠抗βactin mAb作陰性對照, Western blot分析RAI16在再生肝組織中的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在從0.5 h到72 h鼠再生肝組織中, RAI16的表

28、達于0.5 h即可檢測到, 4 h達高峰（圖4）, 提示RAI16直接參與了肝細胞的增殖調(diào)控。</p><p>　　2.6 RAI16多克隆抗體的免疫組化定位 RAI16蛋白是一種定位于胞質(zhì)內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的分泌型的球形信號蛋白［1］。經(jīng)免疫組化實驗證明, RAI16多肽多克隆抗體可與大鼠再生肝細胞胞質(zhì)中的RAI16蛋白結(jié)合(圖5) 。</p><p><b>　　3 討論&l

29、t;/b></p><p>　　隨著人類基因組計劃的完成, 蛋白質(zhì)研究已成為后基因組時代的重要任務。抗體是研究蛋白質(zhì)的必不可少的工具之一, 在一種新的cDNA被克隆后, 由此推譯出的氨基酸序列人工合成多肽并與載體偶聯(lián), 免疫制備其抗體, 是一個快速而有效的手段［3］。抗原表位的選擇是制備合成肽的關鍵。一般認為, 親水性強和具有穩(wěn)定構(gòu)象的線性表位, 對于維持抗原的免疫反應性極其重要［4-7］ 。我們通過綜合分

30、析RAI16的親水性, 柔韌性, 抗原性及表面性4個參數(shù)預測的結(jié)果, 最終確定以親水性強、 抗原指數(shù)高、 表面性及柔韌性好的區(qū)域(即44～55位的11個氨基酸)作為RAI16的抗原決定簇。但有些親水肽段形成的抗原決定簇在變性條件下易受到破壞, 從而影響其抗體的特異性, 因此抗體純化后需要對其進行全面鑒定［6］。由于RAI16在正常肝組織中表達較低, 而在脾臟、 結(jié)腸、 胎盤等組織中有明確的表達, 因此, 我們選擇脾臟組織的蛋白作為電泳樣

31、本, 對純化的兔抗人RAI16合成肽的多克隆抗體進行Western blot特異性分析, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)兔抗人RAI16合成肽的多克隆抗體可特異性識別脾臟組織中Mr約為55 000的蛋白(</p><p><b>　　【參考文獻】</b></p><p>　　［1］ 王 閣, 鄧 婧, 楊 進, 等. 視黃酸誘導蛋白16蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能分析［J］. 世界華人消化雜志, 200

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