Tec酪氨酸激酶作用蛋白RAI16的初步研究.pdf

1、蛋白質間相互作用的研究作為了解蛋白質生物功能的重要手段之一，在功能基因組學研究中極為重要。蛋白質間相互作用存在于機體每個細胞的生命活動過程中。生物學中的許多現(xiàn)象如細胞凋亡、細胞周期調控、信號轉導和癌變等均受蛋白質間相互作用的調控。研究蛋白質間的相互作用有多種方法，常用的如酵母雙雜交系統(tǒng)、親和層析、免疫沉淀、蛋白質交聯(lián)及GST沉淀(GSTpull-down)技術等。其中，酵母雙雜交系統(tǒng)是當前發(fā)展迅速、應用廣泛的主要方法。 Tec(

2、tyrosinekinaseexpressedinhepatocellularcarcinoma)是一種存在于胞質內(nèi)的非受體型蛋白酪氨酸激酶，最初于肝癌組織中篩選得到，它參與多種細胞因子的信號傳遞過程，是多種細胞因子、輔助分子及受體型PTK信號轉導過程中一個重要的靶分子。一方面，Tec能夠對受體型蛋白酪氨酸激酶(包括生長因子受體、細胞因子受體、G蛋白耦聯(lián)受體、抗原受體)及整合素等傳導的各種胞外刺激做出反應[1,2]。同時，Tec可以被許

3、多非受體型蛋白酪氨酸激酶調節(jié)，如：Src、JAK、Syk和FAK家族激酶等。Tec還可以調節(jié)多種主要信號傳導路徑，包括磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)通路、磷脂酶C(PLCr)[3-5]通路以及蛋白激酶C(PKC)通路[6]。研究表明，Tec是造血細胞和免疫細胞活化、發(fā)育、增值和成熟信號轉導途徑中關鍵的蛋白激酶連接分子，而Tec的激酶結構域是其特征性結構之一，通過對這一結構域及其相互作用蛋白分子的研究，將為我們深入地了解Tec的功能，闡

4、明其在細胞擴增及誘導分化信號轉導途徑中的位置和作用提供重要的線索。 我們前期工作以Tec激酶結構域作為“釣餌”蛋白，利用酵母雙雜交技術篩選構建于轉錄激活結構域(AD)載體的cDNA文庫，經(jīng)營養(yǎng)缺陷選擇及誘導篩選，發(fā)現(xiàn)并確證了一個新的陽性克隆。本研究對篩庫所得基因片段測序并經(jīng)BLAST比對分析后，確定為RAI16(Homosapiensretinoicacidinduced16)基因，已被GeneBank收錄(編號為BC05223

5、7)，組織來源為腦Ⅳ型星狀細胞瘤，其編碼蛋白為人視黃酸誘導蛋白16。隨后以RAI16蛋白為切入點，一方面利用相關的生物信息學站點及計算機軟件，對RAI16進行生物信息學分析，從中獲得其編碼蛋白質結構方面的重要信息，從而根據(jù)結構預測其功能；另一方面將RAI16基因構建于原核表達載體中，進行融合表達，并進一步純化融合蛋白，為下一步RAI16功能研究奠定重要基礎。 主要工作內(nèi)容包括： 1.RAI16蛋白生物信息學分析。

6、 生物信息學分析結果提示：編碼蛋白質全長759aa，分子量為83.8kD。該蛋白有很長的酪氨酸尾部，并有一段9aa長的過氧化物酶前導信號2(SKL2)(KLLLVRKQLat698)。蛋白質同源性分析未見有意義的同源蛋白。 RAI16蛋白含有6個可能的PKC磷酸化位點，9個可能的CK2位點，3個Tyr磷酸化位點，6個N-豆蔻?；稽c，2個酰胺化位點，3個酪氨酸硫酸化位點以及1個ATP-GTP結合位點。 RAI16蛋白等電

7、點為5.31，體外半衰期為5.5h，氨基酸組成成分中，亮氨酸含量最高，N端序列考慮為亮氨酸。蛋白不穩(wěn)定性系數(shù)為53.11(Ⅱ級)，該蛋白分類為不穩(wěn)定性蛋白。蛋白脂質系數(shù)為94.23。GRAVY值為-0.136，為親水蛋白。 成熟的RAI16蛋白可以形成α-螺旋、β-折疊及環(huán)狀結構(LOOP)等多種二級結構形式，其中大多為α-螺旋，該蛋白質為一包裹緊密的球狀蛋白。此外，該蛋白無跨膜區(qū)，具有一段由31個氨基酸組成的信號肽，且其切割位

8、點位于30～31aa之間，推測為一種分泌蛋白。其亞細胞定位位于內(nèi)質網(wǎng)上。具有如下幾個半胱氨酸結合區(qū)(95～109、176～236、202～220、269～305、306～365)以及多個蛋白酶切位點。 2.GST-RAI16融合蛋白原核表達質粒的構建。 巢式PCR法擴增目的片段，將其構建到含有GST標記的原核表達載體pGEX4T-2質粒中，與GST基因構成融合基因，并保持靶基因的閱讀框不變。PCR及酶切鑒定正確，DNA測

9、序結果表明，重組質粒中RAI16堿基序列和閱讀框均正確，重組質粒成功，命名為pGEX4T-2/RAI16。 3.GST-RAI16融合蛋白的原核表達及純化。 將重組質粒pGEX4T-2/RAI16轉化入蛋白酶缺陷的大腸桿菌BL-21中，在低溫下(30℃)IPTG(0.4mM)誘導4hr，以超聲細胞破碎儀裂解細菌，取誘導前細菌總蛋白、誘導后培養(yǎng)液上清及誘導后沉淀，經(jīng)10％SDS-PAGE檢測蛋白表達，觀察融合蛋白表達部位與

10、形式，發(fā)現(xiàn)融合蛋白主要以包涵體形式表達，分子量約為75kDa，再依此條件大量誘導表達，將包涵體進行尿素法變性復性處理后，得到可溶的融合蛋白，另外將以可溶形式存在于上清中的表達產(chǎn)物直接過親和層析柱，獲得了可溶的高純度GST-RAI16融合蛋白。 Tec(tyrosinekinaseexpressedinhepatocellularcarcinoma)最早是從肝癌組織中篩選出的一種重要的非受體型蛋白酪氨酸激酶，它存在于胞質內(nèi)，主要在