Tec酪氨酸激酶作用蛋白R(shí)AI16的初步研究.pdf

1、蛋白質(zhì)間相互作用的研究作為了解蛋白質(zhì)生物功能的重要手段之一，在功能基因組學(xué)研究中極為重要。蛋白質(zhì)間相互作用存在于機(jī)體每個(gè)細(xì)胞的生命活動(dòng)過(guò)程中。生物學(xué)中的許多現(xiàn)象如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和癌變等均受蛋白質(zhì)間相互作用的調(diào)控。研究蛋白質(zhì)間的相互作用有多種方法，常用的如酵母雙雜交系統(tǒng)、親和層析、免疫沉淀、蛋白質(zhì)交聯(lián)及GST沉淀(GSTpull-down)技術(shù)等。其中，酵母雙雜交系統(tǒng)是當(dāng)前發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛的主要方法。 Tec(

2、tyrosinekinaseexpressedinhepatocellularcarcinoma)是一種存在于胞質(zhì)內(nèi)的非受體型蛋白酪氨酸激酶，最初于肝癌組織中篩選得到，它參與多種細(xì)胞因子的信號(hào)傳遞過(guò)程，是多種細(xì)胞因子、輔助分子及受體型PTK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中一個(gè)重要的靶分子。一方面，Tec能夠?qū)κ荏w型蛋白酪氨酸激酶(包括生長(zhǎng)因子受體、細(xì)胞因子受體、G蛋白耦聯(lián)受體、抗原受體)及整合素等傳導(dǎo)的各種胞外刺激做出反應(yīng)[1,2]。同時(shí)，Tec可以被許

3、多非受體型蛋白酪氨酸激酶調(diào)節(jié)，如：Src、JAK、Syk和FAK家族激酶等。Tec還可以調(diào)節(jié)多種主要信號(hào)傳導(dǎo)路徑，包括磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)通路、磷脂酶C(PLCr)[3-5]通路以及蛋白激酶C(PKC)通路[6]。研究表明，Tec是造血細(xì)胞和免疫細(xì)胞活化、發(fā)育、增值和成熟信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵的蛋白激酶連接分子，而Tec的激酶結(jié)構(gòu)域是其特征性結(jié)構(gòu)之一，通過(guò)對(duì)這一結(jié)構(gòu)域及其相互作用蛋白分子的研究，將為我們深入地了解Tec的功能，闡

4、明其在細(xì)胞擴(kuò)增及誘導(dǎo)分化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的位置和作用提供重要的線索。 我們前期工作以Tec激酶結(jié)構(gòu)域作為“釣餌”蛋白，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選構(gòu)建于轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)載體的cDNA文庫(kù)，經(jīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷選擇及誘導(dǎo)篩選，發(fā)現(xiàn)并確證了一個(gè)新的陽(yáng)性克隆。本研究對(duì)篩庫(kù)所得基因片段測(cè)序并經(jīng)BLAST比對(duì)分析后，確定為RAI16(Homosapiensretinoicacidinduced16)基因，已被GeneBank收錄(編號(hào)為BC05223

5、7)，組織來(lái)源為腦Ⅳ型星狀細(xì)胞瘤，其編碼蛋白為人視黃酸誘導(dǎo)蛋白16。隨后以RAI16蛋白為切入點(diǎn)，一方面利用相關(guān)的生物信息學(xué)站點(diǎn)及計(jì)算機(jī)軟件，對(duì)RAI16進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從中獲得其編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面的重要信息，從而根據(jù)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)其功能；另一方面將RAI16基因構(gòu)建于原核表達(dá)載體中，進(jìn)行融合表達(dá)，并進(jìn)一步純化融合蛋白，為下一步RAI16功能研究奠定重要基礎(chǔ)。 主要工作內(nèi)容包括： 1.RAI16蛋白生物信息學(xué)分析。

6、 生物信息學(xué)分析結(jié)果提示：編碼蛋白質(zhì)全長(zhǎng)759aa，分子量為83.8kD。該蛋白有很長(zhǎng)的酪氨酸尾部，并有一段9aa長(zhǎng)的過(guò)氧化物酶前導(dǎo)信號(hào)2(SKL2)(KLLLVRKQLat698)。蛋白質(zhì)同源性分析未見(jiàn)有意義的同源蛋白。 RAI16蛋白含有6個(gè)可能的PKC磷酸化位點(diǎn)，9個(gè)可能的CK2位點(diǎn)，3個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)，6個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)，2個(gè)酰胺化位點(diǎn)，3個(gè)酪氨酸硫酸化位點(diǎn)以及1個(gè)ATP-GTP結(jié)合位點(diǎn)。 RAI16蛋白等電

7、點(diǎn)為5.31，體外半衰期為5.5h，氨基酸組成成分中，亮氨酸含量最高，N端序列考慮為亮氨酸。蛋白不穩(wěn)定性系數(shù)為53.11(Ⅱ級(jí))，該蛋白分類(lèi)為不穩(wěn)定性蛋白。蛋白脂質(zhì)系數(shù)為94.23。GRAVY值為-0.136，為親水蛋白。 成熟的RAI16蛋白可以形成α-螺旋、β-折疊及環(huán)狀結(jié)構(gòu)(LOOP)等多種二級(jí)結(jié)構(gòu)形式，其中大多為α-螺旋，該蛋白質(zhì)為一包裹緊密的球狀蛋白。此外，該蛋白無(wú)跨膜區(qū)，具有一段由31個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，且其切割位

8、點(diǎn)位于30～31aa之間，推測(cè)為一種分泌蛋白。其亞細(xì)胞定位位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。具有如下幾個(gè)半胱氨酸結(jié)合區(qū)(95～109、176～236、202～220、269～305、306～365)以及多個(gè)蛋白酶切位點(diǎn)。 2.GST-RAI16融合蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。 巢式PCR法擴(kuò)增目的片段，將其構(gòu)建到含有GST標(biāo)記的原核表達(dá)載體pGEX4T-2質(zhì)粒中，與GST基因構(gòu)成融合基因，并保持靶基因的閱讀框不變。PCR及酶切鑒定正確，DNA測(cè)

9、序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒中RAI16堿基序列和閱讀框均正確，重組質(zhì)粒成功，命名為pGEX4T-2/RAI16。 3.GST-RAI16融合蛋白的原核表達(dá)及純化。 將重組質(zhì)粒pGEX4T-2/RAI16轉(zhuǎn)化入蛋白酶缺陷的大腸桿菌BL-21中，在低溫下(30℃)IPTG(0.4mM)誘導(dǎo)4hr，以超聲細(xì)胞破碎儀裂解細(xì)菌，取誘導(dǎo)前細(xì)菌總蛋白、誘導(dǎo)后培養(yǎng)液上清及誘導(dǎo)后沉淀，經(jīng)10％SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)，觀察融合蛋白表達(dá)部位與

10、形式，發(fā)現(xiàn)融合蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，分子量約為75kDa，再依此條件大量誘導(dǎo)表達(dá)，將包涵體進(jìn)行尿素法變性復(fù)性處理后，得到可溶的融合蛋白，另外將以可溶形式存在于上清中的表達(dá)產(chǎn)物直接過(guò)親和層析柱，獲得了可溶的高純度GST-RAI16融合蛋白。 Tec(tyrosinekinaseexpressedinhepatocellularcarcinoma)最早是從肝癌組織中篩選出的一種重要的非受體型蛋白酪氨酸激酶，它存在于胞質(zhì)內(nèi)，主要在