小麥萌發(fā)種子胚乳和鹽脅迫根尖中內(nèi)肽酶及20S蛋白酶體的研究.pdf

1、以小麥栽培品種揚(yáng)麥158(Triticum aestivum L.， Yangmai158)為實(shí)驗(yàn)材料，研究了小麥種子吸脹及后續(xù)幼苗生長(zhǎng)過(guò)程中胚乳中內(nèi)肽酶（endopeptidases, EPs）的變化和生化特性，以及胚乳中20S蛋白酶體的生化特性和其對(duì)種子萌發(fā)過(guò)程的響應(yīng)；并研究了鹽脅迫下小麥幼苗根尖的氧化傷害對(duì)20S蛋白酶體的影響。主要研究結(jié)果如下：1.小麥種子吸脹后胚乳中半胱氨酸內(nèi)肽酶和20S蛋白酶體的研究
　　 采用與明膠

2、共聚4-20％梯度凝膠電泳的方法研究了小麥種子吸脹后胚乳中內(nèi)肽酶的變化及其生化特性。在小麥種子吸脹0-7 d內(nèi)，小麥胚乳內(nèi)有4種半胱氨酸內(nèi)肽酶(EP1， EP2， EP3和EP4)逐漸出現(xiàn)，且它們的活性都隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加；在這些EPs中，EP2不僅最先出現(xiàn)，而且它的活性在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也一直是最高的。這4種EPs的最適pH都是4.0，最適溫度都是40℃，它們的活性都能被25μME-64完全抑制，因此，這4種EPs都屬于半胱氨

3、酸內(nèi)肽酶。4種EPs對(duì)熱都不很穩(wěn)定，特別是EP1的熱穩(wěn)定性最差。此外，這4種EPs對(duì)成熟小麥籽粒貯藏蛋白質(zhì)，清蛋白，球蛋白，醇溶蛋白和麥谷蛋白有不同的底物專(zhuān)一性。在4種EPs中，EP2對(duì)球蛋白，醇溶蛋白和麥谷蛋白均有最高的蛋白水解活性。綜合以上結(jié)果，我們認(rèn)為EP2可能是與小麥種子萌發(fā)及其幼苗生長(zhǎng)相關(guān)最緊密且最重要的一種內(nèi)肽酶。
　　 首先采用連續(xù)3次離心和梯度PAGE(GPAGE)后切膠回收的方法純化小麥胚乳中的20S蛋白酶體，

4、通過(guò)GPAGE及Western印跡檢測(cè)證明獲得了純的20S蛋白酶體，然后對(duì)20S蛋白酶體和其在小麥種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)過(guò)程中的生化特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，提純的20S蛋白酶體能明顯地切割模式合成底物Z-GGL-AMC和Z-GGR-AMC的芳－肽鍵，表示該20S蛋白酶體具有胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的活性，這兩種蛋白酶活性的最適pH都為8.0，而其胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶活性的最適溫度分別為55℃和37℃，但這兩種蛋白酶活性都能被MG115和P

5、MSF顯著性地抑制。以上結(jié)果表明，我們提純的蛋白酶是一種典型的20S蛋白酶體。結(jié)果同時(shí)還表明，在小麥種子吸脹0-7 d內(nèi)，胚乳內(nèi)多聚泛素化蛋白的含量保持不變.但是與糊粉層相關(guān)的20S蛋白酶體的酪蛋白水解活性和蛋白含量在1-2d內(nèi)逐漸降低，但在2-4 d期間逐漸增加，在4d達(dá)到最高水平，并保持最高水平一直到7d。在2-4 d期間，20S蛋白酶體的β5-亞基mRNA水平增加到較高的水平，20S蛋白酶體的酪蛋白水解活性和蛋白含量相應(yīng)地從3d開(kāi)

6、始逐漸增加。此外，小麥胚乳的主要貯藏蛋白不能被20S蛋白酶體降解。以上結(jié)果進(jìn)一步表明，在小麥種子吸脹后的這段時(shí)間內(nèi)，胚乳中20S蛋白酶體的主要作用可能不是用來(lái)降解胚乳中大量貯藏蛋白的。
　　 2.鹽脅迫下小麥根尖的氧化傷害對(duì)20S蛋白酶體的影響
　　 為研究鹽脅迫下小麥根尖的氧化傷害對(duì)20S蛋白酶體的影響，用200 mM NaCl脅迫小麥幼苗12、24、48和72 h，之后分別取其根尖。測(cè)定了其中H2O2含量、O2-產(chǎn)生

7、的速率、膜脂過(guò)氧化程度和質(zhì)膜完整性；及20S蛋白酶體的羰基化水平、酪蛋白水解活性及蛋白含量變化等生化特性。同時(shí)也測(cè)定了小麥根尖細(xì)胞內(nèi)羰基化蛋白和泛素化蛋白的含量。結(jié)果表明，小麥根尖中H2O2含量、O2－產(chǎn)生的速率、TBARS含量和細(xì)胞死亡數(shù)都隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加。對(duì)根尖進(jìn)行組織染色發(fā)現(xiàn)，膜脂過(guò)氧化和質(zhì)膜完整性破壞的程度和分布范圍隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸加重和擴(kuò)大。在72 h鹽脅迫過(guò)程中，小麥根尖中總酪蛋白水解活性和20S蛋白酶體