血管瘤內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)及其生化、細胞學特性分析.pdf

1、血管瘤內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)及其生化、細胞學特性分析背景：血管瘤是一種小兒常見的良性腫瘤，屬先天性疾患，為毛細血管擴張增生、血管內(nèi)皮細胞增生及血管畸形所致。血管瘤雖然是良性瘤，呈浸潤性，且繼續(xù)不斷生長，范圍較廣，故它影響人體的解剖結構和生理功能，造成畸形及容貌缺陷，而對正常組織往往破壞性較大，有的甚至會威脅生命。但由于對其組織發(fā)生、分化及生物學行為的研究甚少，對其發(fā)病機制仍不完全清楚，目前尚無有效治療措施。 通過對血管瘤內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)及

2、生化生物學分析，對血管瘤的發(fā)生、形成條件、消退機制等會有更進一步的認識，從而為治療提供合理方案、發(fā)現(xiàn)更好的治療藥物、改善血管瘤臨床治療的現(xiàn)狀；同時血管瘤為研究血管內(nèi)皮細胞增殖和血管發(fā)生的信號機制提供了寶貴的實驗模型，可為研究血管發(fā)育提供有益的線索。 目的：本課題旨在掌握血管瘤內(nèi)皮細胞的生長規(guī)律，研究血管瘤及其內(nèi)皮細胞與正常成人血管及其內(nèi)皮細胞在組織結構、生化及生物學特征、培養(yǎng)方法、生長曲線等方面有何異同，其中包括第Ⅷ凝血因子相關

3、抗原和P53蛋白的存在和表達情況，為血管瘤的臨床治療提供理論依據(jù)。 方法：本課題用常規(guī)組織切片技術和染色方法制作血管瘤、正常成人血管及臍靜脈的石蠟組織切片；用間接免疫熒光法和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察第Ⅷ凝血因子相關抗原在其內(nèi)的表達情況；用免疫組化法和共聚焦顯微鏡觀察分析血管瘤細胞中熒光標記的P53蛋白的表達情況、對比不同標本的差異。以新鮮血管瘤為材料，用0.1％的胰酶消化血管瘤內(nèi)皮細胞，用添加了成纖維細胞生長因子(FGF)的含1

4、0％小牛血清的M199培養(yǎng)液在含5％CO2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔兩天換液，待長成單層細胞以后傳代，建立血管瘤內(nèi)皮細胞系，觀察其生長、增殖特征。通過以上試驗對血管瘤內(nèi)皮細胞的生化及生物學特征進行分析。 結果：將皮膚血管瘤組織制成石蠟組織切片后進行常規(guī)HE染色，觀察發(fā)現(xiàn)細胞核呈藍色，胞漿為淡紅色，管腔內(nèi)紅細胞呈橘紅色。組織局部核密集，說明細胞以該位置作為生發(fā)點，不斷增生，向內(nèi)侵襲，形成新的血管腔，小血管明顯增生。

5、 血管瘤組織切片第Ⅷ凝血因子相關抗原免疫組化結果顯示，血管瘤周圍小血管明顯增生。 對制作的組織切片進行P53蛋白免疫組化檢測，比較P53蛋白在組織中的表達情況。結果表明，血管瘤的瘤體組織較正常組織P53蛋白的表達增高。 血管瘤瘤體用胰酶消化成單個細胞進行培養(yǎng)。培養(yǎng)的細胞于24h后開始貼壁生長，一周后只有少量細胞鋪展貼壁生長，兩周后開始生長分裂，三周后細胞開始快速生長，四周后，細胞鋪滿皿底，細胞總數(shù)為2×105/培養(yǎng)皿

6、。用相差倒置顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)所分離的細胞呈上皮細胞形態(tài)。第Ⅷ凝血因子相關抗原為哺乳動物血管內(nèi)皮細胞特異性分子，通過檢測該抗原的存在鑒定哺乳動物的血管內(nèi)皮細胞。在激光掃描共聚焦顯微鏡下，觀察到培養(yǎng)細胞及臍靜脈內(nèi)皮細胞(陽性對照)胞漿內(nèi)呈現(xiàn)綠色熒光，第Ⅷ凝血因子相關抗原表達為陽性；A549上皮細胞(陰性對照)胞漿內(nèi)無綠色熒光，第Ⅷ凝血因子相關抗原表達為陰性。結果表明所培養(yǎng)的細胞為血管內(nèi)皮細胞。 結論：血管瘤是一種以血管增生為主要特征

7、的良性腫瘤。血管和淋巴管內(nèi)皮細胞都具有強增殖力，內(nèi)皮細胞的過度增殖和異常增殖是產(chǎn)生脈管腫瘤的主要基礎。本實驗組織學切片觀察可以看到血管內(nèi)皮細胞增生并侵入腔內(nèi)，小血管明顯增生，與血管瘤組織學特征相符。 血管瘤內(nèi)皮細胞具有一般腫瘤細胞所具有的基本特性。與成人正常血管及其內(nèi)皮細胞相比，血管瘤及其內(nèi)皮細胞在形態(tài)結構、生化生物學特征方面存在差異。 從血管瘤瘤體組織分離細胞，成功培養(yǎng)了血管瘤的內(nèi)皮細胞，可在體外長期傳代培養(yǎng)。分離的細