鰻弧菌感染相關的牙鲆差異表達基因的克隆與分析.pdf

1、本研究以我國重要海水經濟養(yǎng)殖魚類牙鲆(Paralichthys olivaceus)為實驗材料，利用mRNA差異顯示技術(mRNA(differential display，DD)研究了鰻弧菌感染前后差異基因的表達，通過RACE(Rapid amplification of cDNAends,RACE)技術克隆得到了兩個差異片段的全長cDNA，利用生物軟件對基因的生物信息學進行了預測分析，并借助于半定量RT-PCR技術對基因的時空表達進

2、行了較為詳細的研究，現將主要的研究結果分述如下： 1．DD-PCR分離鰻弧菌感染前后差異表達的牙鲆eDNA 采用DD-PCR．對鰻弧菌感染前后差異基因的表達進行了研究，共得到20個感染前后在牙鲆肝臟、腎臟和脾臟中差異表達的cDNA片段。通過對差異片段的回收、再擴增、克隆、測序、序列比對以及驗證分析后，最終得到9個陽性片段，其中兩個片段與已知基因高度同源：一個與牙鲆C3補體(Complement component3)同源

3、；另一個與牙鲆TEGT(testis—enhanced gene transcript)基因同源。其余7個為新的cDNA片段。 半定量RT-PCR結果表明，在檢測的7種組織中，C3補體只在對照組的肝臟中微量表達，注射鰻弧菌6h后在小腸中開始了表達，而且隨著時間的延長，在肝臟和小腸中的表達量呈逐漸增加的趨勢，推測C3補體在牙鲆鰻弧菌中起著重要的免疫調節(jié)作用。 組織表達分析表明，TEGT基因在所檢測的對照組7個組織中均為組成

4、型表達，鰻弧菌感染后的6h，在各個組織中的表達量均增加，其中脾臟增加的最明顯，是對照組的2倍，此后TEGT基因在脾臟中的表達隨時間延長而呈下降的趨勢；注射后的24h時，TEGT基因在肝臟和腎臟中的表達量達到最大，此后也隨時間延長而呈下降的趨勢。這說明TEGT基因存在組成型和誘導型兩種表達機制，在防御病原菌的侵染過程中可能發(fā)揮著重要的作用。 2.牙鲆IL-1RII基因全長cDNA的克隆及分析 通過DD-PCR和RACE技術

5、克隆得到了牙鲆白介素1受體類型Ⅱ(IL-1RII)基因的全長cDNA。序列全長1793bp，包括一個100bp的5'末端非翻譯區(qū)(Untranslated region，UTR)、430bp的3'UTR和長度為1263bp的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)。其中在3'UTR區(qū)還發(fā)現了3個重復的AU(ATTTA)序列。其ORF編碼的蛋白含有420個氨基酸，其中含有一個16個氨基組成的信號肽，該蛋白預測的分子量為4

6、6.65KD，等電點為7.19。生物軟件分析表明，該蛋白具有IL-R.家族的典型結構特征：含有兩個Ig樣的結構和一個跨膜區(qū)；二級結構分析表明它屬于混合型蛋白，空間結構和人IL-1RI晶體結構模型非常相似。通過和真鯛等魚類以及鼠、人等哺乳動物IL-1RII基因的序列比對，發(fā)現了3個脯氨酸殘基的保守位點(第155、263、268位)；同源性分析表明該序列和真鯛、虹鱒的相似性比較高，分別為60.0％和47.4％，在構建的系統進化樹中首先聚在了

7、一起，然后再和小鼠、猴、人等哺乳動物聚集在一起。半定量RT-PCR檢測表明，IL-1RII在正常牙鲆的大多數組織中均表達，注射鰻弧菌6小時后在腎臟和脾臟的表達量顯著增加，分別是對照組的1.9倍和2.0倍。初步分析表明它具有信號轉導功能，在防御細菌侵染的過程中發(fā)揮重要的免疫調節(jié)作用。 3.牙鲆TM4SF4基因全長cNA的克隆及分析 借助于DD-PCR和RACE克隆得到了牙鲆四跨膜超家族成員4(TM4SF4)基因的全長cDN

8、A。該cDNA全長1257bp，其中5'UTR為174bp，3'UTR為489bp，ORF為594bp，可編碼197個氨基酸，蛋白質預測的分子量約為20.58KD，等電點為4.48。它具有四個疏水性跨膜區(qū)和三個保守的CCG(Cys-Cys-Gly)骨架等TM4家族的典型特征結構，同時還發(fā)現一段27個氨基酸組成的序列(<'53>GSGvLMIFPALVFL GLKNNDCCGCCGN<'79>)在所比較的9個物種中高度保守。同源性分析表明

9、該基因的蛋白序列與魚類以及哺乳動物類具有高度的相似性，與河豚的同源性最高為80.2％，與斑馬魚、爪蟾、鼠、猴、人、狗、牛的同源性分別為：68.5％、64.5％、68.0％、65.5％，66.5％、66.5％、66.5％。 組織表達分析表明，牙鲆TMM4SF4基因在對照組的脾臟和腎臟中都只有極其微弱的表達，但鰻弧菌感染以后的6h在脾臟中的表達量急劇增加，達到對照組的5.2倍，注射后的24h在腎臟中的表達量也急劇增加，是對照組的4.