肺癌細胞中sox1調(diào)控ect2的表達

1、<p>　　肺癌細胞中SOX1調(diào)控ECT2的表達</p><p>　　李寧1 李曉冰2 李素云1</p><p>　?。?河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，鄭州，450008；</p><p>　　2河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，鄭州，450008）</p><p>　　[摘要] 目的 探討肺癌細胞中SOX1基因是否直接調(diào)控ECT

2、2的表達。方法 以肺癌細胞株A549細胞為研究對象，Realtime-PCR檢測ECT2表達情況。通過熒光素酶報告檢查法以及染色體免疫共沉淀方法檢測SOX1基因是否直接調(diào)控ECT2的表達。免疫組化檢測60例肺癌組織中ECT2與SOX1表達的關(guān)系。結(jié)果 過表達SOX1后A549細胞中ECT2表達下降，而siRNA抑制SOX1后ECT2表達升高，熒光素酶報告檢查法以及染色體免疫共沉淀方法提示SOX1可直接與ECT2啟動子結(jié)合，抑制ECT2的

3、表達。SOX1與ECT2在肺癌組織中表達負相關(guān)(r=-0.433，P =0.001)。結(jié)論 肺癌細胞A549中SOX1基因直接調(diào)控ECT2的表達。</p><p>　　[關(guān)鍵詞] 肺癌；SOX1；ECT2</p><p>　　SOX1 is a novel transcriptional repressor for ECT2 in human lung cancer</p>

4、<p>　　Li Ning1 Li Xiao-bing2 Li Su-yun1 </p><p>　　1 The First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine;2 Basic Medical College of Henan University of Traditional Chi

5、nese Medicine, China</p><p>　　ABSTRACT Objective To test whether SOX1 is a novel transcriptional repressor for ECT2 in human lung cancer. Methods The expression of ECT2 in the A549 cell was detected by Re

6、altime-PCR. We determined whether SOX1 may regulate the expression of ECT2 by using Chromin immunoprecipitation (ChIP) assay and Luciferase activity assay. Immunohistochemical analysis was used to test whether there is a

7、n inverse correlation between ECT2 and SOX1. Results Ectopic expression of SOX1 in the A549 cell repre</p><p>　　[KEY WORDS] Lung cancer; SOX1; ECT2</p><p>　　肺癌是嚴重危害人類生命和健康的惡性腫瘤之一，也是世界范圍內(nèi)發(fā)病和死亡率最

8、高的癌癥。以順鉑為基礎(chǔ)的化療方案是目前針對NSCLC主要的治療方法，然而，肺癌細胞對順鉑產(chǎn)生的耐藥是困擾臨床的難題[1]。SOX1，即SRY (sex determining region Y)-box 1，屬于具有high mobility group (HMG)-box結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子家族SOX家族的成員。我們前期結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOX1基因在A549細胞中處于非甲基化狀態(tài)，在耐順鉑細胞株A549/cis細胞中處于高甲基化狀態(tài)。抑制SOX1表

9、達可通過激活肺癌細胞自噬能力，從而導(dǎo)致肺癌細胞耐藥[2]。前期實驗我們通過cDNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)過表達SOX1后ECT2基因表達降低，本研究我們將探討肺癌細胞中SOX1基因是否直接調(diào)控ECT2的表達。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p><b>　　1.1 材料與試劑</b></p><p&g

10、t;　　人肺癌細胞株A549細胞為本實驗室保存；SOX1表達質(zhì)粒p-CMV-SOX1及SOX1 siRNA購自吉凱生物，ChIP試劑盒購自Upstate Biotechnology公司，Dual-Luciferase檢測試劑盒及Transfect脂質(zhì)體購自Qiagen公司。其他如RT 及PCR 相關(guān)試劑、DNA Marker、Trizol( TaKaRa 公司)。</p><p>　　1.2 Realtime-

11、PCR檢測ECT2表達情況</p><p>　　培養(yǎng)A549細胞至對數(shù)生長期，轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1或SOX1 siRNA，轉(zhuǎn)染24小時后Trizol 法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。Realtime -PCR檢測ECT2表達情況，以GAPDH為內(nèi)參進行結(jié)果校正。引物序列參見表1。</p><p>　　1.3 染色體免疫共沉淀</p><p>　　培養(yǎng)A54

12、9細胞至對數(shù)生長期，轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1，按照ChIP試劑盒抽提DNA，所需抗體分別加入SOX1抗體及IgG抗體為陰性對照，收集DNA。未加抗體組設(shè)為Input。從NCBI數(shù)據(jù)庫中查出ECT2基因5’端-1000bp至+100bp序列（轉(zhuǎn)錄起始點為0），設(shè)計5對引物(圖. 2A)，用上述5對引物通過Realtime-PCR檢測每個樣本Ct值，靶序列的Ct值=2(Ct of Ip’ed DNA-Ct of input) 。</p

13、><p>　　1.4 熒光素酶報告法</p><p>　　根據(jù)ChIP實驗結(jié)果設(shè)計引物，擴增片段為，包含SOX1結(jié)合位點。擴增產(chǎn)物測序并連接至pGL3熒光質(zhì)粒，構(gòu)建pGL3-ECT質(zhì)粒，培養(yǎng)A549細胞至對數(shù)生長期，分別轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1和pGL3-ECT質(zhì)?；騪-CMV-vector和pGL3-ECT質(zhì)粒，同時均轉(zhuǎn)染phRL-TK renilla質(zhì)粒作為內(nèi)參，通過Dual-Lucif

14、erase檢測試劑盒測熒光值。</p><p>　　1.5 免疫組化檢測肺癌組織中SOX1及ECT2表達情況</p><p>　　60例肺癌組織切片通過脫蠟、抗原修復(fù)程序后分別加入SOX1抗體及ECT2抗體，通過免疫組織試劑盒檢測蛋白表達情況。免疫組化評分按照染色強度分為：0,1,2,3分，而染色面積則按<5% (0分)， 5-25% (1分)， 25-50% (2分)， >

15、50% (3分)。染色強度及染色面積結(jié)合算分，總分0-1分為陰性，>1分為陽性[3]。</p><p>　　1.6 統(tǒng)計學(xué)分析</p><p>　　統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件分析，計數(shù)資料用χ2檢驗，計量資料用t檢驗，以p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。</p><p><b>　　2 結(jié)果</b></p&g

16、t;<p>　　2.1 SOX1調(diào)控ECT2的表達</p><p>　　培養(yǎng)A549細胞至對數(shù)生長期，轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1或SOX1 siRNA，Realtime -PCR檢測ECT2表達。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1質(zhì)粒后，ECT2 mRNA值降低（P <0.05），而轉(zhuǎn)染SOX1 siRNA后，ECT2 mRNA值升高（P <0.05）。見圖1。</p>&

17、lt;p>　　2.2 染色體免疫共沉淀與熒光素酶報告法</p><p>　　培養(yǎng)A549細胞至對數(shù)生長期，轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1，按照ChIP試劑盒抽提DNA，所需抗體分別加入SOX1抗體及IgG抗體為陰性對照，收集DNA。Realtime-PCR檢測每個樣本Ct值，靶序列的Ct值=2(Ct of Ip’ed DNA-Ct of input)。我們發(fā)現(xiàn)相對其他引物，A4靶序列的Ct值較高 （P <

18、0.05），證明SOX1抗體與該段DNA序列可能結(jié)合（圖2B）。為進一步驗證該結(jié)果，我們設(shè)計引物擴增A4片段，連接入pGL3熒光質(zhì)粒。分別轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1和pGL3-ECT質(zhì)?；騪-CMV-vector和pGL3-ECT質(zhì)粒，同時均轉(zhuǎn)染phRL-TK renilla質(zhì)粒作為內(nèi)參，檢測pGL3-ECT質(zhì)粒熒光值變化。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1質(zhì)粒的細胞pGL3-ECT熒光值明顯較轉(zhuǎn)染p-CMV-vector質(zhì)粒的細胞低（P

19、<0.05）。見圖3。</p><p>　　2.3 SOX1與ECT2在肺癌組織中表達負相關(guān)</p><p>　　20例肺癌組織表達SOX1，這20例肺癌組織中有14例ECT2的表達陰性。36例肺癌組織表達ECT2，這些組織中30例SOX1表達陰性(表2)。結(jié)果顯示SOX1與ECT2在肺癌組織中表達負相關(guān)(r=-0.433，P =0.001)。圖4顯示的兩例肺癌組織SOX1與ECT

20、2的表達情況。</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　SOX1，即SRY (sex determining region Y)-box 1，屬于具有high mobility group (HMG)-box結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子家族SOX家族的成員，在胚胎發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[4]。家族中其他成員如SOX9，SOX17可以通過直接與β-caten

21、in結(jié)合，導(dǎo)致β-catenin降解或直接抑制其功能（β-catenin是參與經(jīng)典Wnt通路的重要因子），從而抑制Wnt/β-catenin信號通路[5,6]。在肝癌和宮頸癌細胞中，SOX1發(fā)揮抑癌基因作用，抑制細胞的增長及轉(zhuǎn)移能力[7]。我們以肺癌細胞A549細胞株為研究對象，通過低劑量順鉑長時間處理A549，建立了A549/cis耐順鉑細胞株，通過MSP、BSP甲基化檢測法發(fā)現(xiàn)SOX1基因在A549細胞中處于非甲基化狀態(tài)，而在A54

22、9/cis細胞中處于高甲基化狀態(tài)。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，抑制SOX1表達可激活肺癌細胞自噬能力，從而導(dǎo)致肺癌細胞耐藥[2]。</p><p>　　我們通過基因微陣列分析發(fā)現(xiàn)，過表達SOX1后，A549細胞有130個基因下調(diào)，其中包括ECT2。Epithelial cell transforming sequence 2 (ECT2) 是鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange facto

23、rs，GEFs)之一，GEF促進RhoA，Racl和Cdc42上的GDP置換為GTP，使RhoA，Racl和Cdc42等Rho GTPases活化[8,9]。目前尚未有關(guān)SOX1基因是否直接調(diào)控ECT2表達的報道。</p><p>　　我們發(fā)現(xiàn)過表達SOX1后A549細胞中ECT2表達下降，而抑制SOX1后ECT2表達升高，熒光素酶報告檢查法以及染色體免疫共沉淀方法提示SOX1可直接與ECT2啟動子結(jié)合，抑制EC

24、T2的表達。免疫組化結(jié)果顯示SOX1與ECT2在肺癌組織中表達負相關(guān)。</p><p>　　ECT2在肺癌組織中高表達，并且在轉(zhuǎn)移癌組織中表達更高，與肺癌細胞的分化以及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10]。而SOX1基因在肺癌組織中低表達，啟動子甲基化是導(dǎo)致其低表達的重要原因之一。我們推測可能因SOX1低表達，失去對ECT2的抑制，導(dǎo)致ECT2在肺癌組織中高表達。鑒于SOX1與ECT2均與肺癌的轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，我們下步

25、將進一步深入探討SOX1是否通過抑制ECT2功能參與調(diào)控肺癌細胞遷移能力。</p><p><b>　　參考文獻:</b></p><p>　　[1]Li N, Zhang F, Li S, Zhou S. Epigenetic silencing of MicroRNA-503 regulates FANCA expression in non-small cel

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37、 adenocarcinoma. Cancer science. 2014 Jan 31.</p><p>　　圖1：過表達SOX1后A549細胞中ECT2表達下降，而siRNA抑制SOX1后ECT2表達升高。</p><p>　　圖2：A， 5對引物所擴增的DNA片段位置。B，A4靶序列的Ct值較高 （P <0.05），說明SOX1抗體與該段DNA序列可能結(jié)合。</p>

38、<p>　　圖3：轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1質(zhì)粒的細胞pGL3-ECT熒光值明顯較轉(zhuǎn)染p-CMV-vector質(zhì)粒的細胞低。熒光素酶報告法驗證SOX1與A4靶序列結(jié)合，調(diào)控ECT2的表達。</p><p>　　圖4：免疫組化檢測肺癌組織SOX1與ECT2的表達（×200）。結(jié)果顯示SOX1與ECT2在肺癌組織中表達負相關(guān)。</p><p>　　通訊作者：李素云 E-m