非小細(xì)胞肺癌中LHX2基因異常表達(dá)的microRNA調(diào)控機(jī)制.pdf

1、背景與目的：
　　肺癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的癌癥，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）幾乎占85％以上。LHX2屬于LIM蛋白家族，現(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)，LHX2能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但具有的作用機(jī)制還不是很清楚。microRNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用是通過(guò)與特定靶基因3’UTR種子序列的完全或不完全互補(bǔ)配來(lái)實(shí)現(xiàn)的。研究表明在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中檢測(cè)到了microRNAs表達(dá)的改變。預(yù)測(cè)顯示多個(gè)microRNAs可以靶向LHX2的3’UTR區(qū)域。

2、本研究旨在探討NSCLC中LHX2表達(dá)的microRNA調(diào)控機(jī)制，為NSCLC的早期診斷和治療提供確鑿的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　?。?）Real-Time PCR和Western Blot方法分別檢測(cè)在人正常支氣管細(xì)胞HBE和4株NSCLC細(xì)胞中LHX2基因的mRNA和蛋白的表達(dá)水平以及50對(duì)NSCLC組織樣本中LHX2基因的mRNA表達(dá)水平。
　?。?）將si-LHX2-1和si-LHX2-2轉(zhuǎn)染至NSCLC細(xì)胞株

3、A549和LTEP-α-2中，通過(guò)CCK-8和細(xì)胞集落形成方法觀察細(xì)胞的增殖情況，驗(yàn)證LHX2對(duì)細(xì)胞增殖的作用。
　?。?）生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)分析能夠靶向LHX23’UTR區(qū)域的microRNAs，我們篩選到miR-1238。首先運(yùn)用雙熒光素酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-1238是否與LHX23’UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合，驗(yàn)證miR-1238對(duì)LHX2的靶向作用。然后合成miR-1238 mimics瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A549和LTEP-α

4、-2細(xì)胞，檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后LHX2 mRNA和蛋白表達(dá)變化，
　?。?）Real-Time PCR方法分別檢測(cè)在人正常支氣管細(xì)胞HBE和4株NSCLC細(xì)胞以及50對(duì)NSCLC組織樣本中miR-1238表達(dá)水平，并將其和LHX2的表達(dá)作回歸分析，統(tǒng)計(jì)出NSCLC中LHX2和miR-1238表達(dá)的相關(guān)性。
　　（5）將miR-1238的模擬體mimics轉(zhuǎn)染至NSCLC細(xì)胞株A549和LTEP-α-2中，通過(guò)CCK-8和細(xì)胞集落形成

5、方法觀察細(xì)胞的增殖情況。
　　結(jié)果：
　?。?）a、與HBE相比，LHX2 mRNA和蛋白在NSCLC細(xì)胞株A549、LTEP-a-2、H460和H1299中的表達(dá)均是上升的。b、在50例NSCLC組織樣本中LHX2 mRNA表達(dá)上調(diào)（p<0.05）。綜上所述，LHX2基因在NSCLC中的表達(dá)是上升的。
　?。?）通過(guò)CCK-8和集落形成實(shí)驗(yàn)可知，干擾LHX2基因后，NSCLC細(xì)胞株的增殖是受到抑制的，因此，LHX2基

6、因能夠促進(jìn)NSCLC細(xì)胞株生長(zhǎng)。
　?。?）Dual Luciferase Reporter Assay實(shí)驗(yàn)可知miR-1238可以結(jié)合在LHX2基因的3’UTR區(qū)。NSCLC細(xì)胞株A549和LTEP-α-2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-1238模擬體mimics，LHX2基因的mRNA和蛋白表達(dá)都下降。因此miR-1238下調(diào)LHX2基因的mRNA和蛋白表達(dá)并且這種作用是通過(guò)miR-1238與LHX2基因的3’UTR種子序列直接結(jié)合引起的。<

7、br>　　（4）與HBE相比，在NSCLC細(xì)胞株A549、LTEP-a-2、H1299和H460中miR-1238的表達(dá)是下調(diào)的。在49例NSCLC組織樣本中miR-1238的表達(dá)也是下降的。也就是說(shuō)，在NSCLC中miR-1238是低表達(dá)的。將其和LHX2的表達(dá)作回歸分析發(fā)現(xiàn)NSCLC中兩者的表達(dá)之間是負(fù)相關(guān)的。
　?。?）通過(guò)CCK-8和集落形成實(shí)驗(yàn)可知，miR-1238抑制NSCLC細(xì)胞株的增殖。
　　結(jié)論：
　

8、　NSCLC細(xì)胞中，miR-1238低表達(dá)，LHX2高表達(dá)，并且 miR-1238能夠直接靶向LHX2的3’UTR種子序列。在50對(duì)肺癌組織中，同樣是miR-1238低表達(dá)和LHX2基因高表達(dá)，并且呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。對(duì)miR-1238和LHX2基因功能分析可知，miR-1238能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)，LHX2促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，過(guò)表達(dá)miR-1238能夠下調(diào)LHX2 mRNA和蛋白的表達(dá)量。因此，miR-1238可能是一種抑癌基因，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中