非小細胞肺癌中LHX2基因異常表達的microRNA調控機制.pdf

1、背景與目的：
　　肺癌是世界范圍內最常見的癌癥，其中非小細胞肺癌（NSCLC）幾乎占85％以上。LHX2屬于LIM蛋白家族，現已有研究發(fā)現，LHX2能夠促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但具有的作用機制還不是很清楚。microRNA對基因表達的調節(jié)作用是通過與特定靶基因3’UTR種子序列的完全或不完全互補配來實現的。研究表明在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中檢測到了microRNAs表達的改變。預測顯示多個microRNAs可以靶向LHX2的3’UTR區(qū)域。

2、本研究旨在探討NSCLC中LHX2表達的microRNA調控機制，為NSCLC的早期診斷和治療提供確鑿的實驗依據。
　　方法：
　?。?）Real-Time PCR和Western Blot方法分別檢測在人正常支氣管細胞HBE和4株NSCLC細胞中LHX2基因的mRNA和蛋白的表達水平以及50對NSCLC組織樣本中LHX2基因的mRNA表達水平。
　　（2）將si-LHX2-1和si-LHX2-2轉染至NSCLC細胞株

3、A549和LTEP-α-2中，通過CCK-8和細胞集落形成方法觀察細胞的增殖情況，驗證LHX2對細胞增殖的作用。
　?。?）生物信息學軟件預測分析能夠靶向LHX23’UTR區(qū)域的microRNAs，我們篩選到miR-1238。首先運用雙熒光素酶活性檢測實驗驗證miR-1238是否與LHX23’UTR區(qū)域的種子序列直接結合，驗證miR-1238對LHX2的靶向作用。然后合成miR-1238 mimics瞬時轉染A549和LTEP-α

4、-2細胞，檢測轉染前后LHX2 mRNA和蛋白表達變化，
　?。?）Real-Time PCR方法分別檢測在人正常支氣管細胞HBE和4株NSCLC細胞以及50對NSCLC組織樣本中miR-1238表達水平，并將其和LHX2的表達作回歸分析，統(tǒng)計出NSCLC中LHX2和miR-1238表達的相關性。
　?。?）將miR-1238的模擬體mimics轉染至NSCLC細胞株A549和LTEP-α-2中，通過CCK-8和細胞集落形成

5、方法觀察細胞的增殖情況。
　　結果：
　?。?）a、與HBE相比，LHX2 mRNA和蛋白在NSCLC細胞株A549、LTEP-a-2、H460和H1299中的表達均是上升的。b、在50例NSCLC組織樣本中LHX2 mRNA表達上調（p<0.05）。綜上所述，LHX2基因在NSCLC中的表達是上升的。
　?。?）通過CCK-8和集落形成實驗可知，干擾LHX2基因后，NSCLC細胞株的增殖是受到抑制的，因此，LHX2基

6、因能夠促進NSCLC細胞株生長。
　?。?）Dual Luciferase Reporter Assay實驗可知miR-1238可以結合在LHX2基因的3’UTR區(qū)。NSCLC細胞株A549和LTEP-α-2瞬時轉染miR-1238模擬體mimics，LHX2基因的mRNA和蛋白表達都下降。因此miR-1238下調LHX2基因的mRNA和蛋白表達并且這種作用是通過miR-1238與LHX2基因的3’UTR種子序列直接結合引起的。<

7、br>　?。?）與HBE相比，在NSCLC細胞株A549、LTEP-a-2、H1299和H460中miR-1238的表達是下調的。在49例NSCLC組織樣本中miR-1238的表達也是下降的。也就是說，在NSCLC中miR-1238是低表達的。將其和LHX2的表達作回歸分析發(fā)現NSCLC中兩者的表達之間是負相關的。
　?。?）通過CCK-8和集落形成實驗可知，miR-1238抑制NSCLC細胞株的增殖。
　　結論：
　

8、　NSCLC細胞中，miR-1238低表達，LHX2高表達，并且 miR-1238能夠直接靶向LHX2的3’UTR種子序列。在50對肺癌組織中，同樣是miR-1238低表達和LHX2基因高表達，并且呈現負相關。對miR-1238和LHX2基因功能分析可知，miR-1238能夠抑制腫瘤的生長，LHX2促進腫瘤的生長，過表達miR-1238能夠下調LHX2 mRNA和蛋白的表達量。因此，miR-1238可能是一種抑癌基因，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中