非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡過程中DR5表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制研究.pdf

1、非小細(xì)胞肺癌是一種非常惡性的癌癥，五年存活率只有15％。治療方式現(xiàn)在主要包括手術(shù)治療，放射治療，化學(xué)治療等，其中，化學(xué)治療是一種主要的治療方式。我們利用非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞為模型，研究小分子藥物pemetrexed（培美曲塞）和salermide誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　細(xì)胞凋亡信號通路主要包括線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路以及死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡通路。促凋亡蛋白Bid可以介導(dǎo)外源性和內(nèi)源性凋亡信號通路之間的聯(lián)系。DR5（Deat

2、h Receptor5，死亡受體5）是一個非常重要的TRAIL受體蛋白，可以激活外源性凋亡信號介導(dǎo)的凋亡通路。DR5通過與銜接蛋白FADD結(jié)合，招募下游蛋白pro-caspase-8，形成凋亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體(Death-inducing signaling complex)并導(dǎo)致caspase-8的活化。一方面caspase-8可以激活下游效應(yīng)蛋白caspase-3，-6，-7，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另一方面，在某些細(xì)胞中，caspase-8可

3、以剪切活化Bid(形成tBid)，活化的Bid從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體并且活化線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　一些腫瘤治療的藥物可以特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中DR5的表達(dá)。異常表達(dá)的DR5在腫瘤凋亡方面起著重要的作用。細(xì)胞受到外界脅迫時，DR5可以在沒有配體存在的條件下活化，激活細(xì)胞凋亡信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，一些轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控DR5表達(dá)，比如Sp1，AP1，p53，NFkB，YY1以及CHOP。其中，CHOP可以結(jié)合到DR

4、5啟動子區(qū)域，誘導(dǎo)DR5表達(dá)。此外，CHOP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic Reticulum(ER)stress)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮了重要作用，CHOP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路中持續(xù)異常表達(dá)可以導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞對外界刺激作出的一種反應(yīng)。靜息狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的分子伴侶蛋白(Bip)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的感受器蛋白(IRE1α，PERK，ATF6)結(jié)合，保持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)。當(dāng)細(xì)胞持續(xù)受到外界脅迫時，大量的錯

5、誤折疊蛋白產(chǎn)生并且會在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中累積，Bip與這些錯誤折疊蛋白結(jié)合并且釋放內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的感受器蛋白，解離后的IRE1α，PERK以及ATF6活化以后可以介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下游信號通路。
　　首先，PERK與Bip解離以后可以通過二聚化以及磷酸化修飾激活，進(jìn)而通過eIF2α(translation-initiation factor eIF2α)特異性增加ATF4的轉(zhuǎn)錄，ATF4可以調(diào)控下游基因的表達(dá)，比如ATF3，CHOP。ATF3（活化

6、轉(zhuǎn)錄因子3）和ATF4（活化轉(zhuǎn)錄因子4）屬于ATF/CREB家族成員(activating transcription factor/cyclicAMP response element binding protein(ATF/CREB)family),具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，可以調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　除了PERK，IRE1α和ATF6也是重要的存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受器蛋白。IRE1α與Bip解離后二

7、聚化并具有內(nèi)切核糖核酸酶的活性。它可以移除XBP1mRNA中26個堿基內(nèi)含子，活化的XBP1轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核并誘導(dǎo)下游基因的表達(dá)。另外，ATF6與Bip解離后從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上釋放以后，通過高爾基體以及蛋白酶體S1P和S2P的修飾，變成具有活性形式的ATF6并移至細(xì)胞核，誘導(dǎo)下游靶向基因的表達(dá)。
　　持續(xù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號通路的激活可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。caspases的激活是細(xì)胞凋亡過程中的一個重要過程。正常狀態(tài)下，caspases一般處于非活化狀態(tài)。

8、c-FLIP(cellular FLICE-inhibitory protein)是一個非常重要的凋亡抑制蛋白。死亡受體可以通過FADD(Fas associated death domain)招募caspase-8形成DISC（Death inducing signaling complex凋亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體）。c-FLIP可以競爭性與FADD結(jié)合抑制caspase-8的活性。與此一致，下調(diào)c-FLIP表達(dá)可以增加死亡受體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

9、的概率。
　　培美曲塞(pemetrexed)是一種抗葉酸代謝的化合物，臨床上常與順鉑(cisplatin)聯(lián)合作用治療惡性間皮細(xì)胞瘤和晚期非小細(xì)胞肺癌。培美曲塞抑制嘌呤嘧啶代謝中所需要三種酶的活力，分別是胸苷酸合酶、二氫葉酸還原酶以及甘氨酰胺核苷酸甲酰轉(zhuǎn)移酶。抑制DNA的合成，破壞細(xì)胞的生長。但是培美曲塞抑制細(xì)胞生長，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制還沒有被明確闡述。本文的目標(biāo)之一是闡述培美曲塞誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

10、r>　　我們研究發(fā)現(xiàn)培美曲塞可以上調(diào)死亡受體5(DR5)的表達(dá)，重組腫瘤壞子因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)蛋白與培美曲塞具有協(xié)同作用，使用兩種藥物同時處理非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞可以明顯增加細(xì)胞凋亡的百分率。使用siRNA抑制DR5表達(dá)可以減弱培美曲塞誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這也進(jìn)一步驗證了DR5在其中的作用。此外，我們發(fā)現(xiàn)抑制C/EBP同源蛋白(CHOP)可以減少DR5表達(dá)。FLICE抑制蛋白(c-FLIP)是凋亡相關(guān)蛋白caspase-8的抑制

11、劑，過表達(dá)c-FLIP降低培美曲塞誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡百分率。通過以上實驗結(jié)果我們認(rèn)為DR5和C-FLIP蛋白在培美曲塞誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮了重要作用。
　　利用非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞作為模型，我們研究了另外一種小分子化合物對細(xì)胞凋亡的影響。Salermide是一種新合成的特異性抑制sirtuin1(sirt1)和sirtuin2(sirt2)的小分子化合物，雖然研究表明salermide可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但是具體的分子機(jī)制仍

12、然并不清楚。我們以中國高發(fā)的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)作為研究模型，發(fā)現(xiàn)salermide可以誘導(dǎo)死亡受體5(Death Receptor5)的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而激活凋亡前體蛋白pro-caspase-8，pro-caspase-9以及凋亡效應(yīng)蛋白caspase-3，導(dǎo)致多聚ADP核糖多聚糖(PARP)活性降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路的激活在salermide誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞凋亡中起到了重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白IRE1-α，

13、Bip，ATF3（活化轉(zhuǎn)錄因子3），ATF4（活化轉(zhuǎn)錄因子4），CHOP受salermide刺激表達(dá)上調(diào)，抑制Sirt1和sirt2的表達(dá)也可以得到相同的結(jié)果。并且使用基因沉默方法分別抑制ATF3，ATF4和CHOP的表達(dá)后，salermide誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡減弱。通過以上實驗，我們認(rèn)為salermide激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路，誘導(dǎo)ATF4，ATF3以及CHOP的表達(dá)，導(dǎo)致DR5水平上調(diào)，最終導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡。這項研

14、究不但進(jìn)一步驗證了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路以及DR5活性對于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡起著重要的調(diào)控作用，為以DR5以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路蛋白作為分子靶標(biāo)治療非小細(xì)胞肺癌提供理論上的依據(jù)，并且發(fā)現(xiàn)同時抑制sirtuin1和sirtuin2可以誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡。
　　除了非小細(xì)胞肺癌，我們對卡波西肉瘤的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了研究?？úㄎ魅饬?Kaposi sarcoma)是一種惡性腫瘤，在非洲的一些國家，艾滋病患者以及免疫系統(tǒng)較弱的人群中發(fā)

15、病率較高，并且有很高的致死率。卡波西肉瘤常發(fā)病于皮膚，粘膜以及淋巴結(jié)等部位?？úㄎ魅饬霭捳畈《?Kaposi sarcoma-associated herpesvirus，KSHV，HHV-8)是引發(fā)卡波西肉瘤原因，卡波西肉瘤一般起源于內(nèi)皮淋巴細(xì)胞。在免疫系統(tǒng)正常的人群中，卡波西肉瘤皰疹病毒感染不會引發(fā)疾病。在美國和歐洲的一些發(fā)達(dá)國家，高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(Highly active antiretroviral therapy(HAA

16、RT))能夠有效治療艾滋病人群中卡波西肉瘤患者，但是在非洲一些不發(fā)達(dá)的國家依舊有非常高的發(fā)病率和致死率。
　　截止到目前，KSHV的致癌機(jī)制并不是非常清楚。KSHV編碼的基因中，病毒G蛋白偶聯(lián)受體(viral G-protein-coupled receptor(vGPCR))具有強(qiáng)烈的致癌性。它可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。一些轉(zhuǎn)基因老鼠模型，比如TIE2-tva內(nèi)皮特異性vGPCR轉(zhuǎn)基因老鼠，表明過表達(dá)vGPCR可以誘發(fā)KS樣腫

17、瘤。vGPCR是一種可以持續(xù)活化的非配體依賴性的七次跨膜蛋白。但是一些配體，比如CXCL1(chemokine (C-X-Cmotif)ligand 1)以及CXCL3 (chemokine(C-X-Cmotif)ligand 3)可以增強(qiáng)vGPCR活性。
　　vGPCR可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。很多信號通路可以被vGPCR激活。比如vGPCR可以激活PI3Kγ的活性并誘導(dǎo)腫瘤生成，NFkB在vGPCR誘導(dǎo)的腫瘤生成過程中也發(fā)揮

18、了重要作用。此外，vGPCR可以誘導(dǎo)VEGF(vascular endothelial growth factor)的表達(dá)和分泌，促進(jìn)血管生成。AKT，ERK，p38以及IKKβ可以導(dǎo)致TSC/mTOR的活化以及HIF表達(dá)上調(diào)，激活VEGF。此外，小G蛋白在vGPCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮了重要作用，比如Rac1，抑制Rac1活性可以阻止vGPCR誘導(dǎo)的NFkB，AP-1以及NFAT的活化，抑制腫瘤生成。異常表達(dá)Rac1可以誘導(dǎo)KS樣腫瘤生

19、成。此外，在動物模型中，內(nèi)皮特異性敲除Rac1影響內(nèi)皮細(xì)胞的功能和血管的發(fā)育。
　　Hippo腫瘤抑制信號通路是一條重要的控制器官大小的信號通路。Hippo信號通路的失調(diào)會導(dǎo)致細(xì)胞增殖，腫瘤發(fā)生。Hippo信號通路的主要蛋白包括MST1/2，Lats1/2，以及YAP/TAZ。MST1/2活化Lats1/2后，磷酸化的Lats1/2可以抑制YAP/TAZ的活性，促進(jìn)蛋白酶體依賴性的蛋白降解。相反，去磷酸化的YAP/TAZ定位在細(xì)胞

20、核并且與TEAD家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，控制下游基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖。許多研究表明YAP/TAZ在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用。穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因過表達(dá)YAP的老鼠可以導(dǎo)致組織增生以及腫瘤發(fā)生。
　　在很多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)YAP/TAZ異常表達(dá)并且定位于細(xì)胞核。因此，YAP/TAZ在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。但是，調(diào)控YAP/TAZ的上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不清楚。我們研究發(fā)現(xiàn)在卡波西肉瘤中YAP/TAZ高度異常表達(dá)活化。KSH