維生素d與糖尿病的聯(lián)系研究方案

1、一、立題依據(jù)及意義,糖尿病 （diabetes mellitus）,定義：一種在遺傳和環(huán)境因素長(zhǎng)期共同作用下，由于胰島素分泌絕對(duì)或者相對(duì)不足所導(dǎo)致的漸進(jìn)性蛋白質(zhì)、脂肪、水和電介質(zhì)代謝發(fā)生紊亂的一系列綜合征，其中以高血糖為主要標(biāo)志。,糖尿病患病人數(shù)與日俱增我國(guó)每天新增糖尿病患者約3000例每年大約增加120萬(wàn)例糖尿病患者預(yù)計(jì)到2025年，中國(guó)的糖尿病患者將超過(guò)5000萬(wàn),Ⅱ型糖尿病患病率特點(diǎn),2型糖尿病患者約占糖尿病患者總數(shù)的

2、90%，多發(fā)生于四十歲以上的人群和老年人，近年其發(fā)病年齡有下降趨勢(shì)。 患病率急劇增加血糖升高，但未達(dá)到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)者大量存在各地發(fā)病狀況差異巨大農(nóng)村城市化，糖尿病患病率增加,Ⅱ型糖尿病發(fā)病年齡的年輕化,逐代年輕現(xiàn)象：子代發(fā)病年齡低于父母近年來(lái)兒童2型糖尿病患病率迅速增加，值得關(guān)注,維生素D與Ⅱ型糖尿病,Ⅱ型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)人群總體血清維生素D水平低于非風(fēng)險(xiǎn)人群。伴有輕微腎功能不全的Ⅱ型糖尿病患者，其心血管疾病的發(fā)病率與其維生素

3、D水平呈負(fù)相關(guān)。與那些維生素D濃度高于13.9 nmol/L的患者相比，嚴(yán)重缺乏維生素D(少于13.9 nmol/L)的患者死亡的可能性要高103%，死于心血管疾病的可能性要高95%。,維生素D與Ⅱ型糖尿病的相關(guān)研究,非籍美國(guó)黑人患NIDDM的比例較高，同時(shí)他們的維生素D缺乏率也很高，而補(bǔ)充維生素D對(duì)他們的NIDDM也存在一定的治療作用。 ——The potential to improve diabetes c

4、ontrol with vitamin D replacement in African American patients: case report and literature review 人們一直認(rèn)為，維生素Ｄ含量高可能會(huì)增加人們患ＩＩ型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)，但我們的研究并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這方面的證據(jù)。 克內(nèi)克特博士所進(jìn)行的追蹤研究中，共有１８７人患上ＩＩ型糖尿病。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)獲取的血液樣本排除了年齡、性別和季節(jié)因素后，血液中維

5、生素Ｄ含量和罹患ＩＩ型糖尿病的關(guān)系與之前的看法截然相反 。 ——芬蘭赫爾辛基國(guó)家公共衛(wèi)生研究所的保羅·克內(nèi)克特博士,維生素D預(yù)防Ⅱ型糖尿病的機(jī)制,維生素D在代謝綜合征中有重要作用，具有改善胰島素敏感性作用的潛力。維生素D可以令人體免疫系統(tǒng)保持健康，保護(hù)人體細(xì)胞免遭損壞，如產(chǎn)生胰島素的胰腺細(xì)胞。 肥胖人群中2型糖尿病發(fā)生率增加，也和維生素D有關(guān)：一方面，維生素D易于在人體脂肪沉積，但不再具有生物活性；另

6、一方面，維生素D可以調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞儲(chǔ)脂作用。,,創(chuàng)新之處及目的,目前，關(guān)于2型糖尿病的研究有很多，但大多數(shù)都是研究如何治療的。如果可以通過(guò)一些簡(jiǎn)單的方法來(lái)預(yù)防它在人群中的發(fā)生，效果將更好。從以上的介紹中可以看出維生素D與2型糖尿病的發(fā)生似乎存在一些關(guān)系，所以，針對(duì)這一問(wèn)題，我們小組設(shè)計(jì)了這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，來(lái)探索維生素D對(duì)NIDDM的發(fā)生究竟有什么作用。 我們推斷不同濃度的維生素D對(duì)機(jī)體的作用不同，大劑量維生素D或維生素D缺乏

7、都可能會(huì)促進(jìn)NIDDM的發(fā)生，而少量的維生素D會(huì)減少NIDDM的發(fā)生。如果結(jié)論得到證實(shí)，那么，對(duì)易于發(fā)生維生素D缺乏或過(guò)多的人群相應(yīng)的補(bǔ)充或降低維生素D的攝入，將對(duì)這類人群NIDDM的發(fā)生起到一定的預(yù)防作用。,二、技術(shù)路線,動(dòng)物：120只健康雄性小鼠 藥品：STZ（鏈佐脲菌素，Streptozotocin ）、1,25-(OH)2D3、檸檬酸鹽緩沖液、花生油、肝素儀器設(shè)備：哺乳動(dòng)物手術(shù)器械一套、注射器、試管、便攜式血糖儀、SDS

8、-PAGE電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀、搖床、離心機(jī)、胰島素ELISA 檢測(cè)試劑盒、光學(xué)顯微鏡,實(shí)驗(yàn)步驟,1、模型的建立：取只體重在20～25g的健康雄性小鼠，連續(xù)7d腹腔注射STZ（20 mg·kg-1），期間喂食高熱量食物。分別于注射STZ的第1、2、3、4、6周末各測(cè)一次血糖，以血糖水平持續(xù)高于11.1mmol/L為判斷成模的標(biāo)準(zhǔn)。造模期間死亡動(dòng)物不計(jì)入統(tǒng)計(jì)范圍。,2、動(dòng)物分組：每組30只小鼠（實(shí)驗(yàn)在相對(duì)較暗的環(huán)境中進(jìn)行）糖尿病

9、組，隔日腹腔注射花生油(5μg·kg-1)，共14次；連續(xù)7d腹腔注射STZ（20 mg·kg-1）；分別于注射STZ的第1、2、3、4、6周末各測(cè)一次血糖，以血糖水平持續(xù)高于11.1mmol/L為判斷成模的標(biāo)準(zhǔn)，期間喂食高熱量食物。造模期間死亡動(dòng)物不計(jì)入統(tǒng)計(jì)范圍。少量Vd組，隔日腹腔注射1,25-(OH)2D3（2μg·kg-1），共14次; 連續(xù)7d腹腔注射STZ（20 mg·kg-1），

10、期間喂食高熱量食物。大量Vd組，隔日腹腔注射1,25-(OH)2D3（5μg·kg-1），共14次; 連續(xù)7d腹腔注射STZ（20 mg·kg-1），期間喂食高熱量食物。空白對(duì)照組，隔日腹腔注射花生油(5μg·kg-1)，共14次；連續(xù)7d腹腔注射與糖尿病組等容量檸檬酸鹽緩沖液，期間喂以正常食物。,3、樣本采集與處理：實(shí)驗(yàn)第9周，開(kāi)始記錄一周內(nèi)各組小鼠的尿量和飲水量。第9周結(jié)束后，各組小鼠空腹8小時(shí)

11、后，測(cè)糖耐量。之后，斷尾取血用便攜式血糖儀檢測(cè)血糖水平；采集血清用胰島素ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清胰島素水平；采集肝臟標(biāo)本利用細(xì)胞免疫組化及Western blot法檢測(cè)胰島素受體的表達(dá)情況；采集胰腺標(biāo)本利用Western blot法檢測(cè)胰島細(xì)胞Bax和Bcl-xL蛋白表達(dá)水平；取胰腺制作標(biāo)本，觀察胰島B細(xì)胞損傷情況。,4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：SPSS10.0軟件處理。結(jié)果以±s表示。同組內(nèi)處理前后比較用配對(duì)t檢驗(yàn)。組間比較用完全

12、隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析，若結(jié)果有意義再進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)間比較的SNK-q檢驗(yàn)（Bax、Bcl-xL陽(yáng)性率經(jīng)平方根轉(zhuǎn)化后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析）。糖尿病發(fā)病率用fisher確切概率法。P＜0.05表示差異有顯著性，P＜0.01表示差異有極顯著性。,三、結(jié)果預(yù)測(cè),實(shí)驗(yàn)時(shí)程,,9周后，各組小鼠空腹8小時(shí)后，測(cè)糖耐量。之后，斷尾取血用便攜式血糖儀檢測(cè)血糖水平；采集血清用胰島素ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清胰島素水平；采集肝臟標(biāo)本利用細(xì)胞免疫組化及Weste

13、rn blot法檢測(cè)胰島素受體（IR）的表達(dá)情況；采集胰腺標(biāo)本利用Western blot法檢測(cè)胰島細(xì)胞Bax和Bcl-xL蛋白表達(dá)水平；取胰腺制作標(biāo)本，觀察胰島B細(xì)胞損傷情況。 記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果,并分析.,,數(shù)據(jù)表格,數(shù)據(jù)處理結(jié)果存在具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則結(jié)果說(shuō)明Vd確實(shí)對(duì)2型糖尿病的發(fā)生有所影響。飲水量與尿量：少量組糖尿病組>大量組血糖：少量組糖尿病組>大量組Bcl-xl表達(dá)水平：少量組>糖尿病組>大量組

14、Bax表達(dá)水平：少量組<糖尿病組<大量組胰島B細(xì)胞損傷情況：少量組<糖尿病組<大量組,理想結(jié)果,四、討論,糖尿病是一種代謝紊亂綜合癥。它是由于胰島素分泌相對(duì)或絕對(duì)不足、胰島素活性的缺乏或是胰島素抵抗等原因而導(dǎo)致的以高血糖為特征的疾病。,WHO推薦糖尿病分為四種類型,1型糖尿病又稱胰島素依賴型糖尿病（IDDM）患者病狀通常出現(xiàn)在兒童或青少年時(shí)期。是由各種原因引起的自身免疫機(jī)制紊亂所致的胰島B細(xì)胞破壞，是胰島素

15、分泌絕對(duì)缺乏，血糖升高 。,2型糖尿病又稱非胰島素依賴性糖尿?。∟IDDM）目前認(rèn)為，是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果，病因與胰島素抵抗和胰島素分泌不足有關(guān) 。還可能與向心性肥胖以及衰老所致的體內(nèi)自由基生成增多密切相關(guān)。,關(guān)于NIDDM,由于胰島B細(xì)胞響應(yīng)有缺陷，導(dǎo)致胰島素分泌不足： —產(chǎn)生的數(shù)量 —分泌時(shí)間末梢組織對(duì)胰島素的響應(yīng)性和敏感性都明顯減弱肝臟對(duì)胰島素的敏感性減弱 —對(duì)于正常人來(lái)說(shuō)

16、，胰島素可以抑制肝臟釋放葡萄糖入血。而對(duì)于NIDDM病人，肝臟持續(xù)分解糖原形成葡萄糖進(jìn)入血液。,胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)是指胰島素作用的靶器官對(duì)胰島素作用的敏感性下降，即正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種狀態(tài),2型糖尿病中一部分病人以胰島素抵抗為主，病人多肥胖，因胰島素抵抗，胰島素敏感性下降，初期可能出現(xiàn)血中胰島素增高以補(bǔ)償其胰島素抵抗，隨著病情的發(fā)展，出現(xiàn)胰島素抵抗伴胰島素分泌的絕對(duì)不足。,維

17、生素D,維生素D是類固醇衍生物，屬脂溶性維生素類，其中最主要的是維生素D3。人體內(nèi)的膽固醇在皮膚細(xì)胞被氧化成維生素D3原，經(jīng)紫外線照射轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素D3。維生素D可以調(diào)節(jié)鈣、磷的代謝在一定人群中經(jīng)?？沙霈F(xiàn)維生素D的缺乏，（黑人，不曬太陽(yáng)，飲食不均衡，長(zhǎng)期使用抗癲癇藥物（苯巴比妥））相反也有人過(guò)量補(bǔ)充維生素D造成體內(nèi)維生素D含量過(guò)高 。,維生素D與NIDDM的關(guān)系,研究發(fā)現(xiàn)維生素D與2型糖尿病的發(fā)生關(guān)系密切.低維生素D血癥的人群中2型糖

18、尿病的發(fā)病率明顯增高，而補(bǔ)充維生素D對(duì)這些病人也有一定的治療作用。其機(jī)制可能是低維生素D抑制胰島素的合成和分泌,加重胰島素抵抗而導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生發(fā)展,關(guān)于實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的STZ是鏈脲佐菌素（Streptozotocin），這種化學(xué)物質(zhì)對(duì)胰島β細(xì)胞有選擇性破壞作用 。大劑量注射時(shí)，由于直接引起胰島β細(xì)胞的廣泛破壞，可造成1型糖尿病模型；而注射較少量STZ時(shí)，由于只是破壞一部分胰島β細(xì)胞的功能，造成外周組織對(duì)胰島不敏感，同時(shí)給予高

19、熱量飼料喂養(yǎng)，兩者結(jié)合便誘導(dǎo)出病理、生理改變都接近于人類2型糖尿病的動(dòng)物模型。 本次試驗(yàn)中，相對(duì)于補(bǔ)充Vd的兩組，糖尿病組處于維生素D缺乏的狀態(tài) 。,關(guān)于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),尿量和飲水量： 糖尿病患者在早期通常會(huì)出現(xiàn)有所謂的“三多一少”癥狀：多飲、多食、多尿和消瘦。糖尿病病人血糖升高，而高血糖對(duì)人體損害很大，人體為了保護(hù)自己，不得不通過(guò)尿液排出多余糖分，致使尿量明顯增多。人如果尿得太多，體內(nèi)損失了大量的水分，就會(huì)感到口渴難忍。所以

20、尿量和飲水量明顯增高，可以一定程度上反映是否患糖尿病。若實(shí)驗(yàn)中尿量和飲水量一項(xiàng)出現(xiàn)“少量組<糖尿病組<大量組”現(xiàn)象，則可說(shuō)明大劑量維生素D或維生素D缺乏都會(huì)促進(jìn)NIDDM的發(fā)生，而少量的維生素D會(huì)減少NIDDM的發(fā)生,血糖： 血糖濃度是反映是否患糖尿及病情輕重的最重要的指標(biāo)，為主要的觀察項(xiàng)目。它可以直接反應(yīng)糖尿病的發(fā)病率，比較出不同濃度的Vd對(duì)NIDDM的發(fā)生的影響。,糖耐量： 通俗地說(shuō)

21、就是人體對(duì)葡萄糖的耐受能力。醫(yī)院通常會(huì)對(duì)疑似糖尿病患者進(jìn)行糖耐量測(cè)試，如果糖耐量試驗(yàn)服糖后2小時(shí)血糖介于7.8至 11.1毫摩/升，表明機(jī)體糖耐量能力減低，也就是說(shuō)身體對(duì)糖的吸收和利用比正常狀態(tài)差了。糖耐量越低說(shuō)明機(jī)體對(duì)糖的耐受越差，病情越嚴(yán)重。所以可以通過(guò)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的糖耐量來(lái)反映小鼠是否患糖尿病，及病情輕重程度。,胰島素含量： 該項(xiàng)指標(biāo)可一定程度反映不同濃度維生素D對(duì)胰島素分泌功能的影響。但NIDDM初期可能出現(xiàn)血中胰

22、島素增高以補(bǔ)償其胰島素抵抗，隨著病情的發(fā)展，出現(xiàn)胰島素抵抗伴胰島素分泌的絕對(duì)不足。所以本次試驗(yàn)中該項(xiàng)指標(biāo)需與其他指標(biāo)結(jié)合比較才能發(fā)揮作用。,肝臟胰島素受體（insulin receptor）的表達(dá)水平： 肝臟對(duì)胰島素的敏感性是保證機(jī)體血糖正常的重要因素。一些研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的維生素D可能刺激胰島素受體的表達(dá)從而增強(qiáng)胰島素對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的反應(yīng)，可改善胰島素敏感性，減弱胰島素抗性，對(duì)NIDDM起到預(yù)防作用。實(shí)驗(yàn)可以從這項(xiàng)指標(biāo)來(lái)確

23、定不同濃度的Vd對(duì)IR的表達(dá)有什么作用。,胰島B細(xì)胞Bcl-xl蛋白和Bax蛋白表達(dá)水平： 維生素D有保護(hù)胰島β細(xì)胞和促進(jìn)損傷的β細(xì)胞修復(fù)再生的作用,試驗(yàn)中的Bcl-xl蛋白和Bax蛋白的表達(dá)水平可以反映這一情況。Bcl-xl蛋白可以抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-xl高表達(dá),凋亡指數(shù)低,bcl-2低表達(dá)或不表達(dá),則凋亡指數(shù)高。Bax蛋白情況相反,Bax高表達(dá)時(shí),則凋亡指數(shù)高,Bax低表達(dá)或不表達(dá)時(shí)凋亡指數(shù)低，Bax促進(jìn)凋亡。實(shí)驗(yàn)中

24、測(cè)胰島B細(xì)胞這兩種蛋白的表達(dá)水平就可以判斷胰島B細(xì)胞的破壞情況。,病理切片觀察胰島B細(xì)胞損傷情況： 一定濃度的維生素D有保護(hù)胰島B細(xì)胞和促進(jìn)損傷的B細(xì)胞修復(fù)再生的作用, 而該項(xiàng)指標(biāo)可以直接表示胰島B細(xì)胞的受損情況。若結(jié)果出現(xiàn)胰島B細(xì)胞損傷“少量組<糖尿病組<大量組”的現(xiàn)象，則可證明低濃度的維生素D有保護(hù)胰島B細(xì)胞和促進(jìn)損傷的B細(xì)胞修復(fù)再生的作用，進(jìn)而證明其預(yù)防NIDDM發(fā)生的作用。,其他機(jī)制（本次試驗(yàn)沒(méi)有涉及）

25、,通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外鈣濃度以保證正常的鈣內(nèi)流（維生素D調(diào)節(jié)鈣代謝的作用） —骨骼肌和脂肪組織維持一個(gè)正常的胰島素敏感性所需要的合適的 鈣濃度范圍是很窄的，因此鈣濃度波動(dòng)可能使得這些重要的周圍組織的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)生障礙，使得胰島素轉(zhuǎn)運(yùn)子4的活性下降，從而導(dǎo)致胰島素抵抗。減輕炎癥反應(yīng) —這可能源于維生素受體（VDR）介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用,五、參考文獻(xiàn),1.J Diabetes. 2010 Mar;2(1):36-40.

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