十五艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法

1、HIV病毒模式圖,HIV病毒顆粒由基因組RNA、外膜蛋白Env、衣殼蛋白Gag、逆轉(zhuǎn)錄酶RT，蛋白酶PRO及整合酶IN組成,HIV生活周期,,吸附－穿入－脫殼－生物合成－組裝成熟和釋放,,HIV基因組模式圖,我國(guó)及國(guó)際兩種不同抗HIV治療方案效果比較,注：上標(biāo)字母相同表示組間無顯著差異，上標(biāo)字母不同表示組間差異顯著,項(xiàng)目周期:五年,2005年7月-2010年6月。第一期兩年，2005年7月-2007年6月．全球基金將根據(jù)第一期執(zhí)行情況確

2、定后三年的投入。項(xiàng)目實(shí)施地區(qū)：廣西、貴州、湖南、江西、四川、新疆、云南７個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)） ，35個(gè)地(州、市），76個(gè)項(xiàng)目縣（市、區(qū)）。,總經(jīng)費(fèi)預(yù)算：五年總經(jīng)費(fèi)為9807萬美元,其中全球基金支持約6374萬美元,中國(guó)政府配套約3433萬美元.配套比例逐年增加，由第一年的20%，增加到第五年的50%。兩年經(jīng)費(fèi)預(yù)算：二年預(yù)算約為3100萬美元,其中全球基金支持約2400萬美元,中國(guó)政府配套約700萬美元. 。,目標(biāo)六：建立服務(wù)網(wǎng)絡(luò)，確保

3、針對(duì)艾滋病病人/感染者開展的治療、關(guān)懷和支持等活動(dòng)的開展，包括母嬰阻斷?！』顒?dòng)：在項(xiàng)目省建立和運(yùn)轉(zhuǎn)耐藥監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室,開展耐藥監(jiān)測(cè)工作,幫助擴(kuò)展和改進(jìn)國(guó)家耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)各省省級(jí)建立實(shí)驗(yàn)室定為哨點(diǎn)的項(xiàng)目縣按方案采集血樣,需要了解的主題:,什么是耐藥性? 藥物的作用靶點(diǎn)與機(jī)制? 與病毒的哪些基因有關(guān)? 耐藥性是怎么產(chǎn)生的? 那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)? 耐藥性分類與耐藥機(jī)制。 如何檢測(cè)耐藥株? 檢測(cè)中注意事項(xiàng)。,什么

4、是HIV耐藥性?,HIV耐藥性是指病毒通過自身的遺傳變異，產(chǎn)生對(duì)藥物抑制作用，使藥物敏感性降低或不敏感的現(xiàn)象。,什么是HIV耐藥性?,IC50 = 50% 抑制濃度,藥物的作用靶點(diǎn)與機(jī)制?,藥物的作用靶點(diǎn)與機(jī)制：,Antiretroviral Drugs 2004,NRTIs NNRTIs PIsZidovudineNevirapine*SaquinavirDidanosine Delavirdin

5、eRitonavirStavudineEfavirenz*IndinavirLamivudine*Nelfinavir*ZalcitabineAmprenavirAbacavirLopinavir/r CombivirAtazanavirTrizivirFosamprenavirDidanosine ECStavudine SRFTC,,,,,,Nucle

6、otide RTI TenofovirEntry Inhibitors T20,,藥物的作用靶點(diǎn)與機(jī)制：,耐藥性是怎么產(chǎn)生的?,病毒自身因素 — 內(nèi)因 藥物的選擇壓力 — 外因,耐藥性是怎么產(chǎn)生的?,病毒自身因素 — 內(nèi)因— HIV-l的逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）不具有DNA聚合酶的校正功能， 因此，在復(fù)制過程中，病毒核酸表現(xiàn)出

7、高度的錯(cuò)誤傾向性。 — 在病毒的高速?gòu)?fù)制過程中，高頻率突變?cè)诤芏痰臅r(shí)間內(nèi)隨 時(shí)發(fā)生。 每個(gè)復(fù)制周期產(chǎn)生一個(gè)突變點(diǎn)； 每天產(chǎn)生109 – 1010 個(gè)新病毒； 病毒基因組中平均每個(gè)堿基每天突變一次,耐藥性是怎么產(chǎn)生的?,藥物的選擇壓力 — 外因— 在藥物選擇壓力下，耐藥變異株完全取代藥物敏感株最快 能發(fā)生在14 至28天內(nèi)。,,“Wild” type virus(drug su

8、sceptible),“Mutant” virus(drug resistant),Drug Pressure,,TIME,,,,,,,,,Viral Dynamics and Drug Resistance,,Viral Load &Replication Rate,,,,,Viral Load &Replication Rate,TIME,,,,,Low Replication Rate&Vir

9、al LoadLess “fit” virus,Pressure: Drug A,Pressure: Drug B,Pressure: Drug C,....,(Combined) Use of Active Antiretroviral Agents,,耐藥性是怎么產(chǎn)生的?,— 耐藥株是在病毒自發(fā)性的、高頻率的基因突變中產(chǎn) 生，在藥物選擇性的壓力下優(yōu)勢(shì)復(fù)制的結(jié)果。,那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?,,1.,那些因素促使耐藥性病

10、毒株出現(xiàn)?,病毒學(xué)失敗率 (%),,0,20,40,60,80,100,>95,90-95,80-90,70-80,<70,服藥依從性 (%),,,,,,82.1,71.4,66.7,54.6,21.7,,,2.,那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?,服藥依從性 (%),,2.,那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?,藥物配伍不當(dāng)— 藥代顯著不同藥物配伍,3.,那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?,— 細(xì)胞周期依賴性藥物AZT, D4T (

11、 活化期細(xì)胞)DDI (靜止相細(xì)胞)蛋白酶抑制劑 (活化期細(xì)胞)— 非細(xì)胞周期依賴性藥物3TC, FTC, AbacavirTenofovirNNRTIs,3. 藥物配伍不當(dāng)— 缺乏對(duì)某一時(shí)相細(xì)胞內(nèi)病毒抑制或抑制不足,那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?,— 胃腸道吸收不好：嘔吐，腹瀉；— 隨意間歇服藥；— 與中藥或其他藥物同時(shí)服用。,4. 其他因素,什么是好治療方案?,— 能快速抑制病毒；— 不易產(chǎn)生耐藥性；—

12、 可長(zhǎng)期維持；,耐藥性分類,1、原發(fā)性耐藥(Primary resistance): 病人在接受抗病毒治療前產(chǎn)生了藥物作用靶點(diǎn)的變異，或者感染了耐藥毒株，均降低抗病毒藥物的敏感性。在已經(jīng)開展HAART的國(guó)家普遍存在，感染了耐藥毒株的病人很容易引起藥物治療失敗。2、繼發(fā)性耐藥(Secondary resistance): 病人已經(jīng)接受了抗病毒治療并產(chǎn)生治療失敗，在藥物的選擇壓力下產(chǎn)生的耐藥。,耐藥機(jī)制：,核苷和核苷類似物1、破壞核苷

13、類似物結(jié)合病毒DNA的能力 M184V 突變: RT酶第184位密碼子 的氨基酸由蛋氨酸(M)變成為纈氨酸(V) 。拉米夫定(Lamivudine) Q151M mutation: 在HIV-1中出現(xiàn)低于 5%；HIV-2中出現(xiàn)頻率較高。,耐藥機(jī)制：,2、切除病毒DNA鏈末端的核苷類似物Thymidine analogues mutations: 突變引起ATP或者焦磷酸介導(dǎo)的切除DN

14、A鏈3‘末端核苷類似物。,核苷和核苷類似物,耐藥機(jī)制：,非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI) 突變降低了抑制劑對(duì)酶的結(jié)合力。不同于核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，其單一突變就能導(dǎo)致高度耐藥。如K103N、Y181C。,耐藥機(jī)制：,K103N突變的機(jī)制,耐藥機(jī)制：,蛋白酶抑制劑,突變點(diǎn)的表示方法：,基因的突變通常以字母－數(shù)字－字母的書寫方式來表示，第一個(gè)字母代表野生型病毒株特定密碼子處的氨基酸，第二個(gè)字母代表在特定密碼子處替換了的氨基酸，中間數(shù)字表示

15、突變點(diǎn)的位置。例如：逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）K103N的突變表示逆轉(zhuǎn)錄酶第103位密碼子的氨基酸由天冬酰胺（K）變成為賴氨酸（N）。,如何檢測(cè)耐藥株：,目前耐藥性檢測(cè)有兩種方法，即表型檢測(cè)及基因型檢測(cè)。表型檢測(cè)通過用藥期間的病毒培養(yǎng)進(jìn)行，而基因型檢測(cè)則通過分子生物學(xué)方法檢測(cè)與耐藥性相關(guān)的病毒基因突變?；蛐蜋z測(cè)的費(fèi)用較低，技術(shù)也相對(duì)容易，可在樣品收集后1～2周得到結(jié)果，但分析基因型耐藥檢測(cè)時(shí)，需要掌握大量相關(guān)知識(shí)，如突變與抗病毒藥物及其它藥物的

16、交叉耐藥等，才能對(duì)結(jié)果進(jìn)行正確的分析。表型檢測(cè)可以直接檢測(cè)病毒的耐藥性，但操作復(fù)雜、耗時(shí)，技術(shù)要求高，且非常昂貴，因此目前國(guó)際上廣泛應(yīng)用于臨床的是基因型耐藥檢測(cè)。,如何檢測(cè)耐藥株：,基因型和表型檢測(cè),檢測(cè)中注意事項(xiàng):,— 在病人仍在治療失敗的方案上收集樣品，可保 證耐藥株占總病毒量的20%以上；— 病毒載量< 1000時(shí), 可出現(xiàn)假陰性。,我國(guó)HIV耐藥性本底抽樣調(diào)查結(jié)果,1)對(duì)于RT基因區(qū)共完成對(duì)21個(gè)省區(qū)共143個(gè)

17、樣本的測(cè)序，僅有2例發(fā)現(xiàn)具有輕微耐藥（占總樣本數(shù)的1.4%） 2)對(duì)于蛋白酶基因區(qū)本次調(diào)查共完成20個(gè)省區(qū)168個(gè)樣本的分析，僅發(fā)現(xiàn)有2例樣本（占總樣本數(shù)1.21%）具有輕微耐藥。 結(jié)論：當(dāng)前我國(guó)HIV耐藥性處于較低狀態(tài)，對(duì)于幾乎所有藥物敏感，我國(guó)抗HIV藥物的使用如果有計(jì)劃的開展，應(yīng)當(dāng)會(huì)有較好的效果，但應(yīng)加強(qiáng)治療依從性促進(jìn)工作和耐藥毒株的監(jiān)測(cè)工作。,HIV基因型耐藥性檢測(cè)（序列測(cè)定法）,檢 測(cè) 流 程,病人血漿標(biāo)本,,

18、HIV RNA,,病毒 cDNA,,HIV RT和PR基因片段,,序列測(cè)定,,結(jié)果解釋,RNA提取,逆轉(zhuǎn)錄,PCR擴(kuò)增,,,,特定的解釋系統(tǒng),,標(biāo)本新鮮EDTA抗凝血漿，或-80℃保存，避免反復(fù)凍融,病毒RNA提?。?Qiagen公司試劑盒）,裂解標(biāo)本，滅活RNA酶,加到離心柱中，RNA與硅膠膜結(jié)合,洗兩次，去除雜質(zhì),用無RNA酶的緩沖液洗脫RNA,收集RNA備用,,,,,優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、快速、得率高,逆轉(zhuǎn)錄 RNA cD

19、NA,,反應(yīng)體系： 10XBuffer 1?l dNTP 0.5?l 外側(cè)反向引物 1?l RNase inhibitor 0.25?l M-MuLV RT 0.25?l DEPC水 2?l

20、 RNA模板 5?l42℃水浴1小時(shí)，95℃ 5分鐘滅活RT,巢式PCR擴(kuò)增病毒蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因,第一輪擴(kuò)增反應(yīng)體系： 10XBuffer 5?l MgCl2 3?l dNTP 1?l 外側(cè)正向引物

21、 1?l 外側(cè)反向引物 1?l Taq酶 0.5?l 水 29.5?l cDNA模板 10?l 94℃5min，94℃30sec，55℃30sec，72℃2.5min 30循環(huán),巢式PCR擴(kuò)增病毒蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因,第二輪擴(kuò)增反應(yīng)體系：

22、 10XBuffer 5?l MgCl2 3?l dNTP 1?l 內(nèi)側(cè)正向引物 1?l 內(nèi)側(cè)反向引物 1?l Taq酶 0.5?l 水

23、 29.5?l 第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物 10?l 94℃5min，94℃30sec，55℃30sec，72℃2.5min 30循環(huán),擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定：瓊脂糖凝膠電泳,,擴(kuò)增產(chǎn)物純化QIAquick Gel extraction試劑盒核酸序列測(cè)定雙脫氧鏈末端終止法,:Protease:CCTCAAATCACTCTTTGGCAACGACCCCTCGTCACAGTAAAGATAG

24、GGGGGCAATTAAAGGAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGAAATGAATTTGCCAGGAAAATGGAAACCAAAAATGATAGGGGGAATTGGAGGTTTTATCAAAGTAAGACAGTATGATCAGGTATCCATAGAAATCTGTGGACATAAGGCTGTAGGTACAGTATTAATAGGACCTACACCAGTCAACATAATTGGGAGAAATCT

25、GTTGACTCAGATTGGTTGCACTTTRT:AAATTTTCCCATTAGTCCTATTGAAACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAGGAATGGATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGCCATTGACAGAAGAAAAAATAAAAGCATTAGTAGAAATTTGTACAGAAATGGGAAAGGAAGGAAAAATTTCAAAAATTGGGCCTGAAAATCCATACAATACTCCAGTATTT

26、GCCATAAAGAAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGAGAACTCAATAAAAGAACTCAAGACTTTTGGGAAGTTCAATTAGGAATACCACATCCCGCAGGATTAAAACAGAAAAAATCTGTAACAGTCCTGGATGTGGGTGATGCATATTTCTCAGTCCCTTTAGATAAAGACTTCAGGAAGTACACTGCATTTACCATACCTAGTG

27、TAAACAATGAGACACCAGGGATTAGATATCAGTACAATGTACTTCCACAGGGATGGAAAGGATCACCAGCAATATTCCAATGTAGTATGACAAAGATCTTAGAGCCTTTTAGGAAACAAAATCCAGACATAGTTATCTATCAATACATGGATGATTTGTTAGTAGGATCTGACTTAGAAATAGGGCAGCATAGAGCAAAAATAGAGGAACTGAGACAACA

28、TCTGTTGAGGTGGGGATTTACCACACCAGACAAAAAACATCAGAGAGGACCTTCCATA,利用網(wǎng)絡(luò)工具確定耐藥性突變并進(jìn)行耐藥性解釋,Web站點(diǎn)：http://hivdb.stanford.edu,HIV Drug Resistance Algorithm2,HIV Drug Resistance Algorithm3,HIV Drug resistance database,HIV Drug Resista

29、nce Algorithm1,高度耐藥：大于60分中度耐藥：30－59分低度耐藥：15－29分潛在低度耐藥：10－14分敏感：0－9分,耐藥性突變計(jì)分,HIV-1耐藥性檢測(cè)的臨床指征：（1）抗病毒治療病毒學(xué)失敗需要改變抗病毒治療方案時(shí)應(yīng)進(jìn)行耐藥性檢測(cè)以協(xié)助選擇有效的抗病毒藥物。（2）抗病毒治療病毒載量下降不理想時(shí)可進(jìn)行HIV-1的耐藥性檢測(cè)。（3）抗病毒治療失敗需要進(jìn)行耐藥性檢測(cè)時(shí)，應(yīng)該在病人仍在服藥時(shí)或停藥后立

30、即（4周內(nèi)）進(jìn)行檢測(cè)。,HIV-1耐藥性檢測(cè)的臨床指征：（4）急性HIV－1感染的病人進(jìn)行抗病毒治療，最好進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，對(duì)于選擇合適的抗病毒藥物、取得最佳抗病毒效果很有益處。（5）對(duì)于未經(jīng)抗病毒治療的慢性HIV感染者不一定要做耐藥性檢測(cè)，但當(dāng)有跡象顯示感染的是耐藥性HIV毒株時(shí)（例如感染來自于正在服用抗病毒藥物的病人），就應(yīng)當(dāng)進(jìn)行耐藥性檢測(cè)。（6）不推薦對(duì)病毒載量<1000cp/ml的病人做病毒載量檢測(cè)，因?yàn)椴《舅教?/p>

31、很難擴(kuò)增出目的基因片段,耐藥性檢測(cè)結(jié)果的解釋?HIV-1的耐藥性不是全或無的現(xiàn)象，基因型和表型耐藥性檢測(cè)結(jié)果的分析和解釋都有困難?所有抗病毒治療都是聯(lián)合用藥，他們之間是相互協(xié)同的，即對(duì)一種藥物的敏感性降低并不干擾同一治療方案中其他藥物的抗病毒活性。?藥物即使有耐藥性也可能有益處，因?yàn)橛心退幮酝蛔兊牟《颈让舾卸局甑膹?fù)制適應(yīng)性要差得多。?血清中藥物的水平，特別是蛋白酶類藥物是高度變化的，如果能夠提高血清中蛋白酶類藥物的濃度，低水平

32、的蛋白酶耐藥性有時(shí)能夠被克服。,Nucleoside Resistance Mutations,Zidovudine41, 67, 70, 210, 215, 219 (TAMs)Didanosine65, 74, 75, 184Zalcitabine65, 69, 74, 184Stavudine41, 67, 70, 75, 210, 215, 219(TAMs)Lamivudine184Abacavir41,

33、 65, 67, 70, 74, 115, 184, 210, 215, 219Multinucleoside ResistanceMultiple TAMs41, 67, 70, 210, 215, 219 69 insertion complex 41, 62, 67, 69, 70, 210, 215, 219151 complex 62, 75, 77, 116, 151,NNRT

34、I Resistance Mutations,Nevirapine100, 103, 106, 108, 181, 188, 190, 230Delavirdine103, 181, 230, 236Efavirenz 100, 103, 108, 188L, 190, 225, 230,Protease Resistance Mutations,Indinavir10, 20, 24, 46, 63, 64, 82,

35、84, 90Nelfinavir30, 35, 36, 46, 71, 84, 88, 90Ritonavir8, 10, 20, 33, 36, 54, 63, 71, 82, 84, 90Saquinavir10, 24, 30, 46, 48, 54, 63, 64, 71, 73, 77, 81, 84, 88, 90Amprenavir 10, 32, 46, 47, 50V, 54, 84

36、Lopinavir/r10, 20, 24, 46, 53, 63, 71, 82, 84, 90Atazanavir48, 50L, 71, 84, 88, 90,Key mutations: Nucleoside RTI,M184V: high level resistance to 3TCK65R: Resistance to all nucleoside RTIs except AZT.Selected by te

37、nofovir and other NRTIs (except AZT)Thymidine analogue mutations (TAMs): 41, 67, 70, 210, 215, 219Affect susceptibility to d4T and AZT, abacavir (with multiple TAMs),Key mutations: Non-nucleoside RTI,K103N: high level

38、 resistance to efavirenz and nevirapineK188L: multi NNRTI resistanceUsually resistance to one NNRTI leads to cross-resistance to other NNRTIs,Key mutations: Protease inhibitors,Generally multiple protease mutations nee

39、ded to cause resistanceKey mutations: 90, 48, 50, 82, 845 or more mutations needed to confer resistance to lopinavir/ritonavirD30N is selected by nelfinavir, other PIs usually activeI50V selected by amprenavir, I50L