十五艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法

1、HIV病毒模式圖,HIV病毒顆粒由基因組RNA、外膜蛋白Env、衣殼蛋白Gag、逆轉錄酶RT，蛋白酶PRO及整合酶IN組成,HIV生活周期,,吸附－穿入－脫殼－生物合成－組裝成熟和釋放,,HIV基因組模式圖,我國及國際兩種不同抗HIV治療方案效果比較,注：上標字母相同表示組間無顯著差異，上標字母不同表示組間差異顯著,項目周期:五年,2005年7月-2010年6月。第一期兩年，2005年7月-2007年6月．全球基金將根據(jù)第一期執(zhí)行情況確

2、定后三年的投入。項目實施地區(qū)：廣西、貴州、湖南、江西、四川、新疆、云南７個?。ㄗ灾螀^(qū)） ，35個地(州、市），76個項目縣（市、區(qū)）。,總經(jīng)費預算：五年總經(jīng)費為9807萬美元,其中全球基金支持約6374萬美元,中國政府配套約3433萬美元.配套比例逐年增加，由第一年的20%，增加到第五年的50%。兩年經(jīng)費預算：二年預算約為3100萬美元,其中全球基金支持約2400萬美元,中國政府配套約700萬美元. 。,目標六：建立服務網(wǎng)絡，確保

3、針對艾滋病病人/感染者開展的治療、關懷和支持等活動的開展，包括母嬰阻斷。　活動：在項目省建立和運轉耐藥監(jiān)測實驗室,開展耐藥監(jiān)測工作,幫助擴展和改進國家耐藥監(jiān)測網(wǎng)絡各省省級建立實驗室定為哨點的項目縣按方案采集血樣,需要了解的主題:,什么是耐藥性? 藥物的作用靶點與機制? 與病毒的哪些基因有關? 耐藥性是怎么產生的? 那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)? 耐藥性分類與耐藥機制。 如何檢測耐藥株? 檢測中注意事項。,什么

4、是HIV耐藥性?,HIV耐藥性是指病毒通過自身的遺傳變異，產生對藥物抑制作用，使藥物敏感性降低或不敏感的現(xiàn)象。,什么是HIV耐藥性?,IC50 = 50% 抑制濃度,藥物的作用靶點與機制?,藥物的作用靶點與機制：,Antiretroviral Drugs 2004,NRTIs NNRTIs PIsZidovudineNevirapine*SaquinavirDidanosine Delavirdin

5、eRitonavirStavudineEfavirenz*IndinavirLamivudine*Nelfinavir*ZalcitabineAmprenavirAbacavirLopinavir/r CombivirAtazanavirTrizivirFosamprenavirDidanosine ECStavudine SRFTC,,,,,,Nucle

6、otide RTI TenofovirEntry Inhibitors T20,,藥物的作用靶點與機制：,耐藥性是怎么產生的?,病毒自身因素 — 內因 藥物的選擇壓力 — 外因,耐藥性是怎么產生的?,病毒自身因素 — 內因— HIV-l的逆轉錄酶（RT）不具有DNA聚合酶的校正功能， 因此，在復制過程中，病毒核酸表現(xiàn)出

7、高度的錯誤傾向性。 — 在病毒的高速復制過程中，高頻率突變在很短的時間內隨 時發(fā)生。 每個復制周期產生一個突變點； 每天產生109 – 1010 個新病毒； 病毒基因組中平均每個堿基每天突變一次,耐藥性是怎么產生的?,藥物的選擇壓力 — 外因— 在藥物選擇壓力下，耐藥變異株完全取代藥物敏感株最快 能發(fā)生在14 至28天內。,,“Wild” type virus(drug su

8、sceptible),“Mutant” virus(drug resistant),Drug Pressure,,TIME,,,,,,,,,Viral Dynamics and Drug Resistance,,Viral Load &Replication Rate,,,,,Viral Load &Replication Rate,TIME,,,,,Low Replication Rate&Vir

9、al LoadLess “fit” virus,Pressure: Drug A,Pressure: Drug B,Pressure: Drug C,....,(Combined) Use of Active Antiretroviral Agents,,耐藥性是怎么產生的?,— 耐藥株是在病毒自發(fā)性的、高頻率的基因突變中產 生，在藥物選擇性的壓力下優(yōu)勢復制的結果。,那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?,,1.,那些因素促使耐藥性病

10、毒株出現(xiàn)?,病毒學失敗率 (%),,0,20,40,60,80,100,>95,90-95,80-90,70-80,<70,服藥依從性 (%),,,,,,82.1,71.4,66.7,54.6,21.7,,,2.,那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?,服藥依從性 (%),,2.,那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?,藥物配伍不當— 藥代顯著不同藥物配伍,3.,那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?,— 細胞周期依賴性藥物AZT, D4T (

11、 活化期細胞)DDI (靜止相細胞)蛋白酶抑制劑 (活化期細胞)— 非細胞周期依賴性藥物3TC, FTC, AbacavirTenofovirNNRTIs,3. 藥物配伍不當— 缺乏對某一時相細胞內病毒抑制或抑制不足,那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?,— 胃腸道吸收不好：嘔吐，腹瀉；— 隨意間歇服藥；— 與中藥或其他藥物同時服用。,4. 其他因素,什么是好治療方案?,— 能快速抑制病毒；— 不易產生耐藥性；—

12、 可長期維持；,耐藥性分類,1、原發(fā)性耐藥(Primary resistance): 病人在接受抗病毒治療前產生了藥物作用靶點的變異，或者感染了耐藥毒株，均降低抗病毒藥物的敏感性。在已經(jīng)開展HAART的國家普遍存在，感染了耐藥毒株的病人很容易引起藥物治療失敗。2、繼發(fā)性耐藥(Secondary resistance): 病人已經(jīng)接受了抗病毒治療并產生治療失敗，在藥物的選擇壓力下產生的耐藥。,耐藥機制：,核苷和核苷類似物1、破壞核苷

13、類似物結合病毒DNA的能力 M184V 突變: RT酶第184位密碼子 的氨基酸由蛋氨酸(M)變成為纈氨酸(V) 。拉米夫定(Lamivudine) Q151M mutation: 在HIV-1中出現(xiàn)低于 5%；HIV-2中出現(xiàn)頻率較高。,耐藥機制：,2、切除病毒DNA鏈末端的核苷類似物Thymidine analogues mutations: 突變引起ATP或者焦磷酸介導的切除DN

14、A鏈3‘末端核苷類似物。,核苷和核苷類似物,耐藥機制：,非核苷逆轉錄酶抑制劑(NNRTI) 突變降低了抑制劑對酶的結合力。不同于核苷逆轉錄酶抑制劑，其單一突變就能導致高度耐藥。如K103N、Y181C。,耐藥機制：,K103N突變的機制,耐藥機制：,蛋白酶抑制劑,突變點的表示方法：,基因的突變通常以字母－數(shù)字－字母的書寫方式來表示，第一個字母代表野生型病毒株特定密碼子處的氨基酸，第二個字母代表在特定密碼子處替換了的氨基酸，中間數(shù)字表示

15、突變點的位置。例如：逆轉錄酶（RT）K103N的突變表示逆轉錄酶第103位密碼子的氨基酸由天冬酰胺（K）變成為賴氨酸（N）。,如何檢測耐藥株：,目前耐藥性檢測有兩種方法，即表型檢測及基因型檢測。表型檢測通過用藥期間的病毒培養(yǎng)進行，而基因型檢測則通過分子生物學方法檢測與耐藥性相關的病毒基因突變?；蛐蜋z測的費用較低，技術也相對容易，可在樣品收集后1～2周得到結果，但分析基因型耐藥檢測時，需要掌握大量相關知識，如突變與抗病毒藥物及其它藥物的

16、交叉耐藥等，才能對結果進行正確的分析。表型檢測可以直接檢測病毒的耐藥性，但操作復雜、耗時，技術要求高，且非常昂貴，因此目前國際上廣泛應用于臨床的是基因型耐藥檢測。,如何檢測耐藥株：,基因型和表型檢測,檢測中注意事項:,— 在病人仍在治療失敗的方案上收集樣品，可保 證耐藥株占總病毒量的20%以上；— 病毒載量< 1000時, 可出現(xiàn)假陰性。,我國HIV耐藥性本底抽樣調查結果,1)對于RT基因區(qū)共完成對21個省區(qū)共143個

17、樣本的測序，僅有2例發(fā)現(xiàn)具有輕微耐藥（占總樣本數(shù)的1.4%） 2)對于蛋白酶基因區(qū)本次調查共完成20個省區(qū)168個樣本的分析，僅發(fā)現(xiàn)有2例樣本（占總樣本數(shù)1.21%）具有輕微耐藥。 結論：當前我國HIV耐藥性處于較低狀態(tài)，對于幾乎所有藥物敏感，我國抗HIV藥物的使用如果有計劃的開展，應當會有較好的效果，但應加強治療依從性促進工作和耐藥毒株的監(jiān)測工作。,HIV基因型耐藥性檢測（序列測定法）,檢 測 流 程,病人血漿標本,,

18、HIV RNA,,病毒 cDNA,,HIV RT和PR基因片段,,序列測定,,結果解釋,RNA提取,逆轉錄,PCR擴增,,,,特定的解釋系統(tǒng),,標本新鮮EDTA抗凝血漿，或-80℃保存，避免反復凍融,病毒RNA提?。?Qiagen公司試劑盒）,裂解標本，滅活RNA酶,加到離心柱中，RNA與硅膠膜結合,洗兩次，去除雜質,用無RNA酶的緩沖液洗脫RNA,收集RNA備用,,,,,優(yōu)點：操作簡便、快速、得率高,逆轉錄 RNA cD

19、NA,,反應體系： 10XBuffer 1?l dNTP 0.5?l 外側反向引物 1?l RNase inhibitor 0.25?l M-MuLV RT 0.25?l DEPC水 2?l

20、 RNA模板 5?l42℃水浴1小時，95℃ 5分鐘滅活RT,巢式PCR擴增病毒蛋白酶和逆轉錄酶基因,第一輪擴增反應體系： 10XBuffer 5?l MgCl2 3?l dNTP 1?l 外側正向引物

21、 1?l 外側反向引物 1?l Taq酶 0.5?l 水 29.5?l cDNA模板 10?l 94℃5min，94℃30sec，55℃30sec，72℃2.5min 30循環(huán),巢式PCR擴增病毒蛋白酶和逆轉錄酶基因,第二輪擴增反應體系：

22、 10XBuffer 5?l MgCl2 3?l dNTP 1?l 內側正向引物 1?l 內側反向引物 1?l Taq酶 0.5?l 水

23、 29.5?l 第一輪擴增產物 10?l 94℃5min，94℃30sec，55℃30sec，72℃2.5min 30循環(huán),擴增產物鑒定：瓊脂糖凝膠電泳,,擴增產物純化QIAquick Gel extraction試劑盒核酸序列測定雙脫氧鏈末端終止法,:Protease:CCTCAAATCACTCTTTGGCAACGACCCCTCGTCACAGTAAAGATAG

24、GGGGGCAATTAAAGGAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGAAATGAATTTGCCAGGAAAATGGAAACCAAAAATGATAGGGGGAATTGGAGGTTTTATCAAAGTAAGACAGTATGATCAGGTATCCATAGAAATCTGTGGACATAAGGCTGTAGGTACAGTATTAATAGGACCTACACCAGTCAACATAATTGGGAGAAATCT

25、GTTGACTCAGATTGGTTGCACTTTRT:AAATTTTCCCATTAGTCCTATTGAAACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAGGAATGGATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGCCATTGACAGAAGAAAAAATAAAAGCATTAGTAGAAATTTGTACAGAAATGGGAAAGGAAGGAAAAATTTCAAAAATTGGGCCTGAAAATCCATACAATACTCCAGTATTT

26、GCCATAAAGAAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGAGAACTCAATAAAAGAACTCAAGACTTTTGGGAAGTTCAATTAGGAATACCACATCCCGCAGGATTAAAACAGAAAAAATCTGTAACAGTCCTGGATGTGGGTGATGCATATTTCTCAGTCCCTTTAGATAAAGACTTCAGGAAGTACACTGCATTTACCATACCTAGTG

27、TAAACAATGAGACACCAGGGATTAGATATCAGTACAATGTACTTCCACAGGGATGGAAAGGATCACCAGCAATATTCCAATGTAGTATGACAAAGATCTTAGAGCCTTTTAGGAAACAAAATCCAGACATAGTTATCTATCAATACATGGATGATTTGTTAGTAGGATCTGACTTAGAAATAGGGCAGCATAGAGCAAAAATAGAGGAACTGAGACAACA

28、TCTGTTGAGGTGGGGATTTACCACACCAGACAAAAAACATCAGAGAGGACCTTCCATA,利用網(wǎng)絡工具確定耐藥性突變并進行耐藥性解釋,Web站點：http://hivdb.stanford.edu,HIV Drug Resistance Algorithm2,HIV Drug Resistance Algorithm3,HIV Drug resistance database,HIV Drug Resista

29、nce Algorithm1,高度耐藥：大于60分中度耐藥：30－59分低度耐藥：15－29分潛在低度耐藥：10－14分敏感：0－9分,耐藥性突變計分,HIV-1耐藥性檢測的臨床指征：（1）抗病毒治療病毒學失敗需要改變抗病毒治療方案時應進行耐藥性檢測以協(xié)助選擇有效的抗病毒藥物。（2）抗病毒治療病毒載量下降不理想時可進行HIV-1的耐藥性檢測。（3）抗病毒治療失敗需要進行耐藥性檢測時，應該在病人仍在服藥時或停藥后立

30、即（4周內）進行檢測。,HIV-1耐藥性檢測的臨床指征：（4）急性HIV－1感染的病人進行抗病毒治療，最好進行耐藥性檢測，對于選擇合適的抗病毒藥物、取得最佳抗病毒效果很有益處。（5）對于未經(jīng)抗病毒治療的慢性HIV感染者不一定要做耐藥性檢測，但當有跡象顯示感染的是耐藥性HIV毒株時（例如感染來自于正在服用抗病毒藥物的病人），就應當進行耐藥性檢測。（6）不推薦對病毒載量<1000cp/ml的病人做病毒載量檢測，因為病毒水平太低

31、很難擴增出目的基因片段,耐藥性檢測結果的解釋?HIV-1的耐藥性不是全或無的現(xiàn)象，基因型和表型耐藥性檢測結果的分析和解釋都有困難?所有抗病毒治療都是聯(lián)合用藥，他們之間是相互協(xié)同的，即對一種藥物的敏感性降低并不干擾同一治療方案中其他藥物的抗病毒活性。?藥物即使有耐藥性也可能有益處，因為有耐藥性突變的病毒比敏感毒株的復制適應性要差得多。?血清中藥物的水平，特別是蛋白酶類藥物是高度變化的，如果能夠提高血清中蛋白酶類藥物的濃度，低水平

32、的蛋白酶耐藥性有時能夠被克服。,Nucleoside Resistance Mutations,Zidovudine41, 67, 70, 210, 215, 219 (TAMs)Didanosine65, 74, 75, 184Zalcitabine65, 69, 74, 184Stavudine41, 67, 70, 75, 210, 215, 219(TAMs)Lamivudine184Abacavir41,

33、 65, 67, 70, 74, 115, 184, 210, 215, 219Multinucleoside ResistanceMultiple TAMs41, 67, 70, 210, 215, 219 69 insertion complex 41, 62, 67, 69, 70, 210, 215, 219151 complex 62, 75, 77, 116, 151,NNRT

34、I Resistance Mutations,Nevirapine100, 103, 106, 108, 181, 188, 190, 230Delavirdine103, 181, 230, 236Efavirenz 100, 103, 108, 188L, 190, 225, 230,Protease Resistance Mutations,Indinavir10, 20, 24, 46, 63, 64, 82,

35、84, 90Nelfinavir30, 35, 36, 46, 71, 84, 88, 90Ritonavir8, 10, 20, 33, 36, 54, 63, 71, 82, 84, 90Saquinavir10, 24, 30, 46, 48, 54, 63, 64, 71, 73, 77, 81, 84, 88, 90Amprenavir 10, 32, 46, 47, 50V, 54, 84

36、Lopinavir/r10, 20, 24, 46, 53, 63, 71, 82, 84, 90Atazanavir48, 50L, 71, 84, 88, 90,Key mutations: Nucleoside RTI,M184V: high level resistance to 3TCK65R: Resistance to all nucleoside RTIs except AZT.Selected by te

37、nofovir and other NRTIs (except AZT)Thymidine analogue mutations (TAMs): 41, 67, 70, 210, 215, 219Affect susceptibility to d4T and AZT, abacavir (with multiple TAMs),Key mutations: Non-nucleoside RTI,K103N: high level

38、 resistance to efavirenz and nevirapineK188L: multi NNRTI resistanceUsually resistance to one NNRTI leads to cross-resistance to other NNRTIs,Key mutations: Protease inhibitors,Generally multiple protease mutations nee

39、ded to cause resistanceKey mutations: 90, 48, 50, 82, 845 or more mutations needed to confer resistance to lopinavir/ritonavirD30N is selected by nelfinavir, other PIs usually activeI50V selected by amprenavir, I50L