高效液相色譜在制藥行業(yè)中的應(yīng)用

1、高效液相色譜在制藥行業(yè)中的應(yīng)用應(yīng)用技術(shù)發(fā)展部2011年,北京創(chuàng)新通恒科技有限公司是一家面向全球的專業(yè)HPLC企業(yè)，主要致力于高效液相色譜系統(tǒng)研制、開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)和銷售。 創(chuàng)建于2000年，公司總部位于北京市海淀區(qū)中關(guān)村高科技園區(qū)上地信息產(chǎn)業(yè)基地，是一家極具創(chuàng)造力的國(guó)家級(jí)高新技術(shù)企業(yè)。十年來(lái)一直秉承“精益求精，追求品質(zhì)，值得信賴”傳統(tǒng)，根據(jù)用戶需求，在用戶關(guān)鍵領(lǐng)域進(jìn)行持續(xù)的技術(shù)研發(fā)。 我們擁有卓越的技術(shù)團(tuán)隊(duì)和專

2、家級(jí)的一流研發(fā)人才，“CXTH DAC800工業(yè)化生產(chǎn)型HPLC系統(tǒng)”研發(fā)投產(chǎn)，將中國(guó)工業(yè)化色譜系統(tǒng)推向世界前列，這是中國(guó)大型純化分離研發(fā)領(lǐng)域的一座里程碑；“CXTH Kilotide500 DNA合成儀”投入使用，彌補(bǔ)中國(guó)大型合成設(shè)備領(lǐng)域的空白。,關(guān)于我們,,國(guó)家級(jí)高新技術(shù)企業(yè),國(guó)家級(jí)軟件產(chǎn)品企業(yè),創(chuàng)新通恒,科學(xué)技術(shù)部技術(shù)創(chuàng)新基金,國(guó)家級(jí)、北京市創(chuàng)新基金,關(guān)于我們,軟件著作權(quán)7項(xiàng),儀器儀表協(xié)會(huì)創(chuàng)新金獎(jiǎng),DAC800大型工業(yè)化制備色譜系

3、統(tǒng)BCEIA金獎(jiǎng),發(fā)明專利3項(xiàng)，實(shí)用新型專利13項(xiàng),公司資質(zhì)、獎(jiǎng)項(xiàng),北京創(chuàng)新通恒科技有限公司,北京鋼臣科技有限公司,,總經(jīng)理辦公室,開(kāi)發(fā)部,財(cái)務(wù)部,營(yíng)銷事業(yè)部,中小設(shè)備加工中心,應(yīng)用技術(shù)發(fā)展部,工業(yè)化設(shè)備加工中心,上海辦事處,成都辦事處,廣州辦事處,售后技術(shù)支持中心,組織構(gòu)架,走近我們,,引言： HPLC的特點(diǎn)H

4、PLC在制藥行業(yè)中的應(yīng)用藥物色譜分析方法的開(kāi)發(fā)藥物色譜純化方法的建立和優(yōu)化：從分析到工業(yè)制備,,目 錄,內(nèi)容提要,引言,HPLC的特點(diǎn)：高效：分離效能高高靈敏度應(yīng)用范圍廣：70%以上的有機(jī)化合物可以用HPLC分析分析速度快條件溫和，樣品不被破壞分析HPLC由于靈敏度高，快速簡(jiǎn)便，廣泛地應(yīng)用于藥物分析制備HPLC是目前分離與純化領(lǐng)域中處理多組分復(fù)雜體系的最有效的方法,,引言： HPLC的特點(diǎn)HPLC在制藥行業(yè)中的應(yīng)

5、用藥物色譜分析方法的開(kāi)發(fā)藥物色譜純化方法的建立和優(yōu)化：從分析到工業(yè)制備,,目 錄,內(nèi)容提要,分析型HPLC在制藥行業(yè)中的應(yīng)用,檢測(cè)藥物含量 天然藥物化學(xué)成分復(fù)雜，有效成分可能有一個(gè)，也可以有多個(gè)，因此精確測(cè)定各有效成分的含量對(duì)藥品質(zhì)量控制，建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有重要的意義。高效液相色譜法由于其專一性、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)可廣泛應(yīng)用于藥物分析中的定量分析，尤其在干擾因素見(jiàn)多的時(shí)候表現(xiàn)出更大的優(yōu)越性。藥效檢測(cè)：藥物代謝動(dòng)力學(xué)

6、研究，新藥效能研究檢測(cè)藥物殘留,三七藥材組分分析：,感冒清熱顆粒中的葛根素有效成分分析：,,,,半制備型HPLC在制藥行業(yè)中的應(yīng)用,高通量篩選活性物質(zhì)實(shí)驗(yàn)室規(guī)模純化（克級(jí)）,DISCOVERY ACTIVE COMPONENT發(fā)現(xiàn)活性,高通量篩選活性物質(zhì),中藥提取物或發(fā)酵液等的分析譜圖,哪個(gè)才是活性組分 ？,高通量篩選活性物質(zhì),用半制備色譜系統(tǒng)，對(duì)可能具有生物活性的組分，多次進(jìn)樣，分段制備幾十毫克做活性研究，最終確定活性組分,,

7、,,,,,,高通量篩選活性物質(zhì),制備HPLC在制藥行業(yè)中的應(yīng)用,純化藥物有效成分高附加值產(chǎn)品（如紫杉醇、長(zhǎng)春堿等癌癥治療藥物）上樣量大，附加值低產(chǎn)品（甜菊糖苷等附加值低的藥物輔料）工藝改進(jìn)類產(chǎn)品（增大生產(chǎn)量或提高產(chǎn)品純度類產(chǎn)品）,,制備HPLC在制藥行業(yè)中的應(yīng)用,,小試級(jí)制備色譜系統(tǒng)：方法的放大及標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品的制備。,中試級(jí)制備色譜系統(tǒng)：年產(chǎn)公斤級(jí)至百公斤級(jí),DAC800 型工業(yè)化色譜：年產(chǎn)噸級(jí),,引言： HPLC的特點(diǎn)

8、HPLC在制藥行業(yè)中的應(yīng)用藥物色譜分析方法的開(kāi)發(fā)藥物色譜純化方法的建立和優(yōu)化：從分析到工業(yè)制備,,目 錄,內(nèi)容提要,液相色譜實(shí)驗(yàn)所需的基本參數(shù)流動(dòng)相：種類及配比，等度或梯度固定相：色譜柱類型及內(nèi)徑、長(zhǎng)短流動(dòng)相輸送系統(tǒng)參數(shù)：流速檢測(cè)器參數(shù)溫度控制進(jìn)樣量以上參數(shù)即構(gòu)成一個(gè)具體的HPLC方法；亦稱色譜條件,藥物色譜分析方法的開(kāi)發(fā),高壓輸液泵的選擇,平流（單泵）高壓梯度使用多臺(tái)色譜泵，在泵后混合配置靈活、簡(jiǎn)單，脫氣

9、簡(jiǎn)單低壓梯度用單泵產(chǎn)生梯度，泵前混合對(duì)脫氣要求高,檢測(cè)器的選擇,a、紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器 應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器，是在UV及VIS區(qū)有吸收物質(zhì)檢測(cè)的首選檢測(cè)器。b、示差折光檢測(cè)器 一種通用型的檢測(cè)器，靈敏度偏低，對(duì)溫度穩(wěn)定性要求過(guò)高，不 能用于梯度洗脫。通常用來(lái)分析糖類及高聚物（GPC）c、熒光檢測(cè)器 靈敏度極高，常用來(lái)進(jìn)行痕量檢測(cè)。d、二極管陣列檢測(cè)器（DAD） 可用于全波長(zhǎng)的檢測(cè)，可以

10、測(cè)量峰純度，可在線得到色譜圖和光譜圖。e、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 一種通用型檢測(cè)器，它可以檢測(cè)揮發(fā)性低于流動(dòng)相的任何樣品。ELSD可以用于測(cè)量無(wú)生色團(tuán)物質(zhì)的檢測(cè)，如碳水化合物、類脂物、聚合物、不進(jìn)行衍生化的脂肪酸及氨基酸、表面活性劑及結(jié)構(gòu)不明又無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的物質(zhì)的檢測(cè)。,根據(jù)分離模式劃分的色譜柱類型,色譜柱的選擇,常用色譜柱類型,1.ODS（C18）—應(yīng)用范圍最廣的填料，大部分小分子有機(jī)化合物都可進(jìn)行分析2.C8、C4—保留要比C18弱，

11、適合用于大分子的多肽和蛋白類的分離純化3.氨基柱—正反雙模式，主要用于小分子糖類化合物4.苯基柱—通常用于分離含苯環(huán)的化合物5.氰基柱—正反雙模式，和ODS基不同的色譜間作用力，因而氰基柱擁有獨(dú)特的選擇性6.正向硅膠7.環(huán)糊精—根據(jù)物質(zhì)光學(xué)性質(zhì)的不同進(jìn)行手性分離,進(jìn)樣系統(tǒng)的選擇,六通進(jìn)樣閥,六通閥的構(gòu)造a. Load狀態(tài)b. Inject狀態(tài),自動(dòng)進(jìn)樣器,,為保證重現(xiàn)性以及峰形等，很多情況下需要使用柱溫箱來(lái)控制柱溫。,選配

12、：恒溫裝置,,引言： HPLC的特點(diǎn)HPLC在制藥行業(yè)中的應(yīng)用藥物色譜分析方法的開(kāi)發(fā)藥物色譜純化方法的建立和優(yōu)化：從分析到工業(yè)制備,,目 錄,內(nèi)容提要,藥物色譜純化方法的建立和優(yōu)化：從分析到工業(yè)制備,理論的放大設(shè)備的放大,分析型色譜：線性色譜指組分在固定性和流動(dòng)相中的平衡濃度呈正比例關(guān)系，即吸附（分配）等溫線為一條直線。用于分離和鑒別樣品中的組分，為此希望能在盡可能小的進(jìn)樣量下，提供盡可能高的組分分辨率。,制備色譜：非線

13、性色譜在制備色譜中，進(jìn)樣量一般都比較大，例如在克量級(jí)范圍，這時(shí)樣品在流動(dòng)相和固定相中的比例不再是正比例的關(guān)系，相對(duì)應(yīng)的吸附（分配）等溫線將發(fā)生彎曲。用于分離、富集或純化混合物中的某一或某些組分，為此需要一定的處理量，一般進(jìn)樣量比分析型色譜大得多。能有適當(dāng)?shù)姆蛛x度，并要考慮層析分離過(guò)程的規(guī)模、速率和分離成本。,理論的放大：非線性色譜,理論的放大：非線性色譜,制備色譜峰型,理論的放大：非線性色譜,理論的放大：非線性色譜,濃度超

14、載進(jìn)樣,體積超載進(jìn)樣,PK,Langmuir型容量因子降低，峰形從高斯曲線變?yōu)槿切?提高樣品的濃度，保持進(jìn)樣體積不變；取決于組分在流動(dòng)相中的溶解度,峰高不變，峰變寬并呈矩形,取決于進(jìn)樣體積，生產(chǎn)效率決定于制備柱直徑，需要小顆粒填料,理論的放大：過(guò)載進(jìn)樣,理論的放大：過(guò)載進(jìn)樣,理論的放大：過(guò)載進(jìn)樣,應(yīng)盡可能選用流動(dòng)相來(lái)溶解樣品，但應(yīng)注意樣品在流動(dòng)相中應(yīng)有良好的溶解度。同時(shí)，若樣品體積太大，分辨能力就會(huì)下降；若樣品過(guò)濃，則可能在柱的頂部形

15、成沉淀。盡管如此，為每次可分離得到更多的樣品，還是應(yīng)在小體積的流動(dòng)相中溶解較多的樣品?？蓪悠啡苡诓煌诹鲃?dòng)相的溶劑，但用此法時(shí)需很謹(jǐn)慎。,設(shè)備的放大：分析設(shè)備與制備設(shè)備,設(shè)備的放大：分析設(shè)備與制備設(shè)備,設(shè)備的放大：分析設(shè)備與制備設(shè)備,分析,制備,,放大,優(yōu)化分析方法的選擇性,,在分析柱上進(jìn)行超量載樣,,放大到制備柱,設(shè)備的放大：過(guò)程,完全線性放大,設(shè)備的放大：過(guò)程,可完全線性放大原因：可達(dá)到30000每米的塔板數(shù)，

16、幾乎與10um填料的分析柱柱效相當(dāng),800DAC柱效測(cè)試結(jié)果圖,設(shè)備的放大：過(guò)程,上樣量的調(diào)整：mp/ma=lp/la * rp /raL:柱長(zhǎng)；m：進(jìn)樣量；r：色譜柱內(nèi)徑 p: 制備柱；a：分析柱,重點(diǎn)1,2,2,設(shè)備的放大：公式,流速的調(diào)整：Fp/Fa = Vp/Va = Lp/La * rp /raF ：流速 ；V:柱體積；L:柱長(zhǎng)；r：色譜柱內(nèi)徑； p: 制備柱；a：

17、分析柱,重點(diǎn)2,2,2,設(shè)備的放大：公式,梯度的調(diào)整方法：tp/ta = Vp/Va * Fp/FaF ：流速 ；V:柱體積；t:梯度洗脫時(shí)間； p: 制備柱；a：分析柱,重點(diǎn)3,設(shè)備的放大：公式,example,樣品：粗品含量大約68%，白色粉末狀固體，對(duì)熱（能夠耐受100攝氏度）和光穩(wěn)定,客戶要求：純化后純度大于99%，單雜小于0.8%，回收率達(dá)到70%,1 step:了解客戶需求,從分析到制備

18、的過(guò)程：案例,2 step:原始樣品分析,example,用分析型HPLC（填料5u甚至更?。?duì)樣品進(jìn)行分離，并對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行改進(jìn)，直到主峰和雜質(zhì)完全分離，摸索好的條件用來(lái)對(duì)以后純化后的樣品進(jìn)行純度分析。,從分析到制備的過(guò)程：案例,example,分析條件：甲醇：乙腈：水=81：12：7檢測(cè)波長(zhǎng)：246nm流速：1.0mL/min柱子：C18，5μm，4.6*250mm,結(jié)果,從分析到制備的過(guò)程：案例,,3 step:分析柱模

19、擬制備,,填料粒徑≥ 10um，4.6*250mm的柱子,不加非揮發(fā)性的酸堿鹽，重新摸索制備條件,主峰和雜質(zhì)分離充分的條件下開(kāi)始做過(guò)載實(shí)驗(yàn),將主峰分段收集，一般為分成10段左右,分別測(cè)定純度，計(jì)算回收率，進(jìn)一步優(yōu)化制備條件,從分析到制備的過(guò)程：案例,從分析到制備的過(guò)程：案例,example,分析柱模擬制備譜圖,結(jié)果,從分析到制備的過(guò)程：案例,4 step:確定最大上樣量,不斷增大上樣量，直到回收率明顯下降理論上樣量：填料質(zhì)量的3‰-

20、--8‰，可以從3‰逐漸增大來(lái)確定最大上樣量,example,60%乙腈，進(jìn)樣量4‰時(shí)，收率為36.3%,60%乙腈，進(jìn)樣量3‰時(shí)，收率為78.9%,選擇上樣量為3 ‰,,,從分析到制備的過(guò)程：案例,最終確定的制備條件：流動(dòng)相：60%乙腈-水上樣量：填料質(zhì)量的3‰填料：XX牌-C8-10um-100A樣品溶劑：流動(dòng)相,從分析到制備的過(guò)程：案例,,5step:放大,分析柱模擬制備的條件及上樣量等線性放大到制備柱上,重復(fù)幾次，至工

21、藝成熟后，可以每次將主峰只分為4-6段,將主峰分段收集，一般為分成10段左右,分別測(cè)定純度，計(jì)算回收率，進(jìn)一步優(yōu)化制備條件,公式見(jiàn)前面，制備柱規(guī)格根據(jù)實(shí)際樣品量來(lái)決定,從分析到制備的過(guò)程：案例,100DAC中試放大,,從分析到制備的過(guò)程：案例,工業(yè)化制備系統(tǒng)純化最終藥物,從分析到制備的過(guò)程：案例,,,從分析到制備的過(guò)程：案例,純化后的樣品分析譜圖,從分析到制備：5要素,1）制備的目的是在一次操作中盡 可能地多上樣，所以，首

22、先得 在分析柱上實(shí)現(xiàn)超載，否則， 分析柱分離得再漂亮，再在制 備柱中線性放大時(shí)就因?yàn)槌杀?不合理而被無(wú)情地否決。2）制備的目的是分離你所關(guān)心的組分，只要它能與其它雜質(zhì)分離的好就行了，所以不要希望在分析柱上先得到所有組分的基線分離，完全沒(méi)有必要！3）制備中常常因?yàn)槌d而無(wú)法使目的物與鄰近雜質(zhì)間達(dá)到基線分離，可以采用分段收集的方法得到指定純度的目的物，要求越純，單次操作的得率也越低。