高效液相色譜原理及應(yīng)用

1、高效液相色譜原理及特點(diǎn)高效液相色譜原理及特點(diǎn)高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論，在技術(shù)上，流動(dòng)相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達(dá)4.9′107Pa）；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬(wàn)或幾十萬(wàn)）；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。一、高效液相色譜儀有哪些特點(diǎn)？1高壓：液相色譜法以液體為流動(dòng)相（稱(chēng)為載液），液體流經(jīng)色譜柱，受到阻力較大，為

2、了迅速地通過(guò)色譜柱，必須對(duì)載液施加高壓。一般可達(dá)150～350105Pa。2高速：流動(dòng)相在柱內(nèi)的流速較經(jīng)典色譜快得多，一般可達(dá)1～10mlmin。高效液相色譜法所需的分析時(shí)間較之經(jīng)典液相色譜法少得多，一般少于1h。3高效：近年來(lái)研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。4高靈敏度：高效液相色譜已廣泛采用高靈敏度的檢測(cè)器，進(jìn)一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測(cè)器靈敏度可達(dá)1011g。另外，用樣量小，一般幾個(gè)微升。5適應(yīng)范圍寬：氣相色譜法與高

3、效液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，但是受技術(shù)條件的限制，沸點(diǎn)太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行分析。而高效液相色譜法只要求試樣能制成溶液，而技術(shù)平臺(tái)〉〉〉高效液相色譜儀原理不需要汽化，因此不受試樣揮發(fā)性的限制。對(duì)于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、相對(duì)分子量大（大于400以上）的有機(jī)物（這些物質(zhì)幾乎占有機(jī)物總數(shù)的75%～80%）原則上都可應(yīng)用高效液相色譜法來(lái)進(jìn)行分離、分析。據(jù)統(tǒng)計(jì)，

4、在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70%～80%。二、高效液相色譜法可分為哪幾種主要類(lèi)型？各自的分離原理是什么？高效液相色譜按其固定相的性質(zhì)可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜以及高效聚焦液相色譜等類(lèi)型。用不同類(lèi)型的高效液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對(duì)應(yīng)的普通液相層析的原6空間排阻色譜法空間排阻色譜法以凝膠(gel)為固定相。它

5、類(lèi)似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數(shù)納米到數(shù)百納米。溶質(zhì)在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來(lái)進(jìn)行分離，而是按分子大小進(jìn)行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流動(dòng)力學(xué)體積或分子大小有關(guān)。試樣進(jìn)入色譜柱后，隨流動(dòng)相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過(guò)。在試樣中一些太大的分子不能進(jìn)入膠孔而受到排阻，因此就直接通過(guò)柱子，首先在色譜圖上出現(xiàn)，一些很小的分子可以進(jìn)入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最后出現(xiàn)

6、。3、高效液相色譜儀各個(gè)系統(tǒng)的組成和特點(diǎn)是什么？高效液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，下面將分別敘述其各自的組成與特點(diǎn)。1進(jìn)樣系統(tǒng)一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作，進(jìn)樣量是恒定的。這對(duì)提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。2輸液系統(tǒng)該系統(tǒng)包括高壓泵、流動(dòng)相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l.47～4.4107Pa，流速可調(diào)且穩(wěn)定，當(dāng)高壓流動(dòng)相通過(guò)層析柱時(shí)，可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng)，可加

7、快其在柱中的移動(dòng)速度，這對(duì)提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動(dòng)相貯存器和梯度儀可使流動(dòng)相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、pH值，或改用競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(zhì)（即使僅有一個(gè)基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體）都能獲得有效分離。3分離系統(tǒng)該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長(zhǎng)度為10～50cm（需要兩根連用時(shí)，可在二者之間加一連接管），內(nèi)徑為2～5mm，由優(yōu)質(zhì)不銹鋼、厚壁玻

8、璃管或鈦合金等材料制成，柱內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質(zhì)和固定液構(gòu)成）。固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹(shù)脂或硅膠構(gòu)成，它們都有惰性、多孔性和比表面積大的特點(diǎn)，加之其表面經(jīng)過(guò)機(jī)械涂漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣），或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因（如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長(zhǎng)度碳鏈的烷基等）或配體的有機(jī)化合物。因此，這類(lèi)固定相對(duì)結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集（PSA）后，就可以把成