四章節(jié)微生物生長和純培養(yǎng)

1、第四章 微生物的生長和純培養(yǎng),生長與繁殖的概念生長——微生物細(xì)胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行新陳代謝，當(dāng)同化作用>異化作用時(shí)，生命個(gè)體的重量和體積不斷增大的過程。繁殖——生命個(gè)體生長到一定階段，通過特定方式產(chǎn)生新的生命個(gè)體，即引起生命個(gè)體數(shù)量增加的生物學(xué)過程。,發(fā)育——從生長到繁殖，是生物的構(gòu)造和機(jī)能從簡單到復(fù)雜、從量變到質(zhì)變的發(fā)展變化過程，這一過程稱為發(fā)育。個(gè)體生長——微生物細(xì)胞個(gè)體吸收營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行新陳代謝，原生質(zhì)與細(xì)胞組分的增加

2、為個(gè)體生長。群體生長——群體中個(gè)體數(shù)目的增加。可以用重量、體積、密度或濃度來衡量。（由于微生物的個(gè)體極小，所以常用群體生長來反映個(gè)體生長的狀況）個(gè)體生長?個(gè)體繁殖? 群體生長 群體生長 = 個(gè)體生長 + 個(gè)體繁殖,在微生物學(xué)中把從一個(gè)細(xì)胞或一群相同的細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)繁殖而得到的后代,稱純培養(yǎng)。在微生物學(xué)中培養(yǎng)和發(fā)酵兩個(gè)概念是相同。在工業(yè)上大規(guī)模的進(jìn)行微生物培養(yǎng)稱為微生物發(fā)酵。,第一節(jié) 微生物生長測(cè)定,描述不同種類、不同生長狀態(tài)

3、的微生物生長情況，需選用不同的測(cè)定指標(biāo)。（一）微生物細(xì)胞數(shù)目的檢測(cè)法直接法（血球計(jì)數(shù)板、比例計(jì)數(shù)法）間接法（活菌計(jì)數(shù)法、液體稀釋法、膜過濾法）（二）微生物生長量和生理指標(biāo)測(cè)定法直接法(干重法，堆體積法)間接法（比濁法，碳、氮含量法，其它生理指標(biāo)）,一、直接計(jì)數(shù)法1、顯微計(jì)數(shù)法（血球計(jì)數(shù)板法）原理：將1cm2×0.1mm的薄層空間劃分為400小格，從中均勻分布地選取80或100小格，計(jì)數(shù)其中的細(xì)胞數(shù)目，換算成單位

4、體積中的細(xì)胞數(shù)。,適用范圍：個(gè)體較大細(xì)胞或顆粒，如血球、酵母菌等。不適用于細(xì)菌等個(gè)體較小的細(xì)胞，因?yàn)椋?）細(xì)菌細(xì)胞太小，不易沉降；（2）在油鏡下看不清網(wǎng)格線，超出油鏡工作距離。 特點(diǎn)：快速，準(zhǔn)確，對(duì)酵母菌可同時(shí)測(cè)定出芽率，或在菌懸液中加入少量美藍(lán)可以區(qū)分死活細(xì)胞。,2、比濁法（比色發(fā)）,原理是在一定范圍內(nèi)，菌懸液中的細(xì)胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌數(shù)越多，光密度越大。因此，借助于分光光度計(jì)，在一定波長下測(cè)定菌懸液的光

5、密度，就可反應(yīng)出菌液的濃度。,特點(diǎn)：快速、簡便；但易受干擾。,3.平板菌落計(jì)數(shù)法技術(shù)要求：樣品充分混勻，操作熟練快速（15~20min完成操作），嚴(yán)格無菌操作；注意事項(xiàng)：每一支吸管只能用于一個(gè)稀釋度，樣品混勻處理，傾注平板時(shí)的培養(yǎng)基溫度；適用范圍：中溫、好氧和兼性厭氧、能在營養(yǎng)瓊脂上生長的微生物；誤差：多次稀釋造成的誤差是主要來源，其次還有由于樣品內(nèi)菌體分布不均勻、以及不當(dāng)操作。,4、干重測(cè)定法 將一定量的菌液中的菌體通

6、過離心或過濾分離出來,然后烘干(干燥溫度可采用105℃、100℃或80℃)、稱重。一般干重為濕重的10%—20%，而一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞一般重約10-12—10-13g。 該法適合菌濃較高的樣品。如大腸桿菌一個(gè)細(xì)胞一般重約10–12~10–13g，液體培養(yǎng)物中細(xì)胞濃度達(dá)到2×109個(gè)/ml時(shí)，100ml培養(yǎng)物可得10~90mg干重的細(xì)胞。,5、菌絲長度測(cè)定法該法適用于對(duì)絲狀真菌生長長度的測(cè)定。方法：將真菌接種在固體培養(yǎng)基

7、的平皿中央，定時(shí)測(cè)定菌落的直徑或面積，直到菌落覆蓋整個(gè)平皿。缺點(diǎn)：不能反映菌絲的縱向生長，不能計(jì)算菌落的厚度和培養(yǎng)集中的菌絲。接種量也能影響結(jié)果，不能反映菌絲的總量。也可用U型管培養(yǎng)法，該法方便不易污染，但通氣不良。,6、細(xì)胞堆積體積測(cè)定法方法：將細(xì)胞懸浮液裝入毛細(xì)沉淀管內(nèi)，離心，根據(jù)堆積體積計(jì)算含菌量。該法快速、簡便，培養(yǎng)液中如有其他固體顆粒，則誤差較大。也可以用有刻度的離心管離心，通過所得的沉淀體積推算出細(xì)胞的質(zhì)量。,7、

8、電子計(jì)數(shù)器法方法：在計(jì)數(shù)器中放有電解質(zhì)及兩個(gè)電極，將電極一端放入帶微孔的小管，通電抽真空，使含有菌體的電解質(zhì)從小孔進(jìn)入管內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞通過小孔時(shí)，電阻增大，電阻增大會(huì)引起脈沖變化，則每個(gè)細(xì)胞通過時(shí)均被記錄下來。因樣品的體積已知，故可以計(jì)算菌體的濃度，同時(shí)菌體的大小與電阻的大小成正比。該方法方便、快捷，但不能測(cè)定含有顆粒的菌液，對(duì)鏈狀和絲狀菌無效。,8、液體稀釋法,9、薄膜過濾計(jì)數(shù)法,常用該法測(cè)定含菌量較少的空氣和水中的微生物數(shù)目。將定

9、量的樣品通過薄膜（硝化纖維素薄膜、醋酸纖維薄膜）過濾，菌體被阻留在濾膜上，取下濾膜進(jìn)行培養(yǎng)，然后計(jì)算菌落數(shù)，可求出樣品中所含菌數(shù)。,10、涂片染色法,應(yīng)用：可同時(shí)計(jì)數(shù)不同微生物的菌數(shù)，適 于土壤、牛奶中細(xì)菌計(jì)數(shù)。 方法：用鏡臺(tái)測(cè)微尺計(jì)算出視野面積；取 0.1ml菌液涂于1cm2面積上，計(jì)數(shù)后代入公式： 每ml原菌液含菌數(shù)= 視野中平均菌數(shù)×涂布面積/

10、視野面積 ×100 ×稀釋倍數(shù),二、間接測(cè)定法1、測(cè)定細(xì)胞的組分含量進(jìn)行估算（1）測(cè)定DNA的含量（2）測(cè)定蛋白質(zhì)的含量（3）測(cè)定ATP的含量,2、從培養(yǎng)基中的某營養(yǎng)物的消耗來估算 3、從菌體代謝產(chǎn)物來估算 4、從發(fā)酵液的黏度來估算 5、從發(fā)酵的放熱量估算 6、從發(fā)酵液的酸堿度來估算,測(cè)含氮量 蛋白質(zhì)是細(xì)胞的主要物質(zhì)，含量穩(wěn)定，而氮是蛋白質(zhì)的主要成分，通過測(cè)含氮量就可推知微生物的濃度

11、。 一般細(xì)菌含氮量為干重的12.5%，酵母菌為7.5%，霉菌為6.0%，根據(jù)一定體積培養(yǎng)液中的含氮量再乘以6.25，就可測(cè)得粗蛋白的含量。 含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、產(chǎn)二氧化碳、產(chǎn)酸、產(chǎn)熱、粘度等，都可用于生長量的測(cè)定。,第二節(jié) 微生物的生長規(guī)律,由于微生物細(xì)胞極其微小，研究其個(gè)體生長存在著技術(shù)上的困難。 同步生長的概念：一個(gè)細(xì)胞群體中各個(gè)細(xì)胞都在同一時(shí)間進(jìn)行分裂的狀態(tài)，稱為同步生長，進(jìn)

12、行同步分裂的細(xì)胞稱為同步細(xì)胞。 同步細(xì)胞群體在任何一時(shí)刻都處在細(xì)胞周期的同一相，彼此間形態(tài)、生化特征都很一致，因而是細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)等研究的良好材料。,獲得同步生長的方法主要有兩類： 環(huán)境條件誘導(dǎo)法：變換溫度、光線、培養(yǎng)基等。造成與正常細(xì)胞周期不同的周期變化。 選擇法：選擇性過濾、梯度離心。物理方法，隨機(jī)選擇，不影響細(xì)胞代謝。,一、單細(xì)胞微生物的群體生長曲線,單細(xì)胞微生物主要包括細(xì)菌和酵母菌，其群

13、體生長是以群體中細(xì)胞數(shù)量的增加來表示的， 由一個(gè)細(xì)胞分裂成為兩個(gè)細(xì)胞的時(shí)間間隔稱為世代，一個(gè)世代所需的時(shí)間就是代時(shí)，代時(shí)也就是群體細(xì)胞數(shù)目擴(kuò)大一倍所需 時(shí)間，有時(shí)也稱為倍增時(shí)間。單位時(shí)間內(nèi)繁殖的代數(shù)成為生長速率。,圖中表示的是一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過若干代分裂后的情況。從圖可見，每經(jīng)過一個(gè)代時(shí)，細(xì)胞數(shù)目就增加一倍，呈指數(shù)增加，因而被稱為指數(shù)生長，這就是單細(xì)胞群體生長的特征。,以細(xì)菌為例介紹單細(xì)胞微生物群體生長規(guī)律，其結(jié)論也基本適用于酵母菌

14、。 生長曲線代表了細(xì)菌在新的環(huán)境中從開始生長、分裂直至死亡的整個(gè)動(dòng)態(tài)變化過程。 每種細(xì)菌都有各自的典型生長曲線，但它們的生長過程卻有著共同的規(guī)律性。一般可以將生長曲線劃分為四個(gè)時(shí)期。,生長曲線： 把少量的細(xì)菌接種到合適的液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定單位體積的細(xì)胞數(shù)，并繪制所得的曲線：以細(xì)菌細(xì)胞數(shù)目的對(duì)數(shù)作縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，得出細(xì)菌在生長過程中的曲線圖。根據(jù)生長曲線的變化規(guī)律，可

15、分為延遲期、對(duì)數(shù)生長期、穩(wěn)定期、衰亡期四個(gè)階段。,微生物的生長規(guī)律,,,,,,,,,,,,,延滯期 對(duì)數(shù)生長期 穩(wěn)定期 衰亡期 單細(xì)胞微生物的典型生長曲線,細(xì)胞數(shù)目的對(duì)數(shù),微生物的生長曲線,將少量單細(xì)胞的純培養(yǎng)，接種到一恒定容積的新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間取樣，測(cè)菌細(xì)胞數(shù)目。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌增長數(shù)目的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制所得的曲線。,1、延

16、遲期 是微生物細(xì)胞進(jìn)入新環(huán)境的適應(yīng)時(shí)期，也是細(xì)胞調(diào)整其大分子和小分子物質(zhì)的組成（包括酶和細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分）又稱為調(diào)整期。 微生物延遲期的長短以細(xì)菌、酵母較短，霉菌次之，放線菌最長。 其它名稱：停滯期、調(diào)整期、適應(yīng)期。,現(xiàn)象：活菌數(shù)沒增加，曲線平行于橫軸。 特點(diǎn)：生長速率常數(shù)= 0；細(xì)胞形態(tài)變大或增長；細(xì)胞內(nèi)RNA特別是rRNA含量增高，原生質(zhì)嗜堿性增強(qiáng)；合成代謝活躍（核糖體、酶類、ATP合成加快）

17、，易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶；對(duì)外界不良條件敏感，（如氯化鈉濃度、溫度、抗生素、化學(xué)藥物、輻射等） 原因：適應(yīng)新的環(huán)境條件，合成新的酶，積累必要的中間產(chǎn)物。,影響延滯期長短的因素,菌種 ：繁殖速度較快的菌種的延遲期一般較短。接種物菌齡 ：用對(duì)數(shù)生長期的菌種接種時(shí)，其延遲期較短，甚至檢查不到延遲期。接種量：一般來說，接種量增大可縮短甚至消除延遲期（發(fā)酵工業(yè)上一般采用1/10的接種量）。培養(yǎng)基成分：在營養(yǎng)成分豐富的天然培養(yǎng)基上生長的延滯期比在合

18、成培養(yǎng)基上生長時(shí)短；接種后培養(yǎng)基成分有較大變化時(shí)，會(huì)使延滯期加長，所以發(fā)酵工業(yè)上盡量使發(fā)酵培養(yǎng)基的成分與種子培養(yǎng)基接近。,對(duì)實(shí)踐的指導(dǎo)意義：,在發(fā)酵工業(yè)上需設(shè)法盡量縮短延遲期；采取的縮短延遲期的措施有：①增加接種量； （群體優(yōu)勢(shì)----適應(yīng)性增強(qiáng)） ②采用對(duì)數(shù)生長期的健壯菌種；③調(diào)整培養(yǎng)基的成分，在種子基中加入發(fā)酵培養(yǎng)基的某些成分。④選用繁殖快的菌種在食品工業(yè)上，盡量在此期進(jìn)行消毒或滅菌,2、對(duì)數(shù)生長期 代時(shí)以G表示，

19、生長速率已R表示，設(shè)t1時(shí)刻的菌數(shù)為N1，經(jīng)過n次分裂后，t2時(shí)刻的菌數(shù)為N2,例如：一培養(yǎng)液中微生物數(shù)目由開始的12，000（ B ），經(jīng)4h （ t ）后增加到49，000，000（ b ），這樣， n ＝ (lg4.9×107－lg1.2×104）÷0.301＝12,借助于 n 和 t ，還可以計(jì)算出不同培養(yǎng)條件下的代時(shí)G， G ＝ t / n在本例中， G ＝4×

20、;60 / 12 ＝20min∴該種微生物的代時(shí)為20分鐘。在4小時(shí)內(nèi)共繁殖了12代。,代時(shí)能夠反應(yīng)細(xì)菌的生長速率，代時(shí)短，生長速率快，代時(shí)長，生長速率慢。在很多微生物學(xué)研究中常常要了解微生物的代時(shí)。 代時(shí)在不同種微生物中的變化很大，多數(shù)微生物的代時(shí)為1~3h,然而有些快速生長的微生物的代時(shí)還不到10min,而另一些微生物的代時(shí)卻可長達(dá)幾小時(shí)或幾天；另外，同一種微生物，在不同的生長條件下其代時(shí)的長短也不同；但是，在一定條件下

21、，每一種微生物的代時(shí)是恒定的，因此它是微生物菌種的一個(gè)重要特征。,一些細(xì)菌的代時(shí),菌名 培養(yǎng)基 培養(yǎng)溫度 代時(shí)E. coli（大腸桿菌） 肉湯 37℃ 17minE. coli 牛奶 37 12.5Enterobacter aerog

22、enes（產(chǎn)氣腸細(xì)菌） 肉湯或牛奶 37 16~18E. aerogenes 組合 37 29~44B. Cereus（蠟狀芽孢桿菌） 肉湯 30 18B. thermophilus（嗜熱芽孢桿菌） 肉湯 55 18.3Lactobacillus

23、acidophilus（嗜酸乳桿菌） 牛奶 37 66~87Streptococcus lactis（乳酸鏈球菌） 牛奶 37 26S. lactis 乳糖肉湯 37 48Salmonella typhi（傷寒沙門氏菌） 肉湯 37 23.5Azotobacter chroococcum（褐

24、球固氮菌） 葡萄糖 25 344~46 Mycobacterium tuberculosis（結(jié)核分枝桿菌）組合 37 792~93 Nitrobacter agilis（活躍硝化桿菌） 組合 27 1200,不同溫度下的代時(shí),溫度對(duì)微生物的代時(shí)有明顯影響： E. Coli 在不同溫度下的代時(shí)溫度（℃）代時(shí)（分）溫度（℃）代時(shí)（分） 10 8

25、60 35 22 15 120 37 17 20 90 40 17.5 25 40 45 20 30 29 47.5 77,現(xiàn)象：細(xì)胞數(shù)目以幾何級(jí)數(shù)增加，其對(duì)數(shù)與時(shí)間呈直線關(guān)系。 特點(diǎn)：（1）生長速率常數(shù)最大，即代時(shí)最短；（2）細(xì)胞進(jìn)行平衡生長，菌體大小、形態(tài)、生理特征等比較一致；（3）代謝最旺盛；

26、（4）細(xì)胞對(duì)理化因素較敏感影響因素：（1）菌種 （2）營養(yǎng)成分 （3）營養(yǎng)物濃度（4）培養(yǎng)溫度,對(duì)實(shí)踐的指導(dǎo)意義：①由于此時(shí)期的菌種比較健壯，增殖噬菌體的最適菌齡；生產(chǎn)上用作接種的最佳菌齡；②發(fā)酵工業(yè)上盡量延長該期，以達(dá)到較高的菌體密度③食品工業(yè)上盡量使有害微生物不能進(jìn)入此期④是生理代謝及遺傳研究或進(jìn)行染色、形態(tài)觀察等的良好材料。,營養(yǎng)物濃度與對(duì)數(shù)期生長速率和產(chǎn)量,作用方式：影響微生物的生長速率和總生長量。生長限制因子：

27、凡是處于較低濃度范圍內(nèi)，可影響生長速率和菌體產(chǎn)量的營養(yǎng)物就稱生長限制因子。,3、穩(wěn)定期,又稱：恒定期或最高生長期特點(diǎn)：①新增殖的細(xì)胞數(shù)與老細(xì)胞的死亡數(shù)幾乎相等，微生物的生長速率處于動(dòng)態(tài)平衡，培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)目達(dá)到最高值。②細(xì)胞分裂速度下降，開始積累內(nèi)含物，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌開始產(chǎn)芽孢。③此時(shí)期的微生物開始合成次生代謝產(chǎn)物，對(duì)于發(fā)酵生產(chǎn)來說，一般在穩(wěn)定期的后期產(chǎn)物積累達(dá)到高峰，是最佳的收獲時(shí)期。,產(chǎn)生原因：營養(yǎng)物尤其是生長限制因子的耗盡

28、；營養(yǎng)物的比例失調(diào)，如碳氮比不合適；有害代謝廢物的積累（酸、醇、毒素等）；物化條件（pH、氧化還原勢(shì)等）不合適。,對(duì)實(shí)踐的指導(dǎo)意義：（1）發(fā)酵生產(chǎn)形成的重要時(shí)期（抗生素、氨基酸等），生產(chǎn)上應(yīng)盡量延長此期，提高產(chǎn)量，措施如下： 補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)（補(bǔ)料即流加） 調(diào)pH 調(diào)整溫度 （2）穩(wěn)定期細(xì)胞數(shù)目及產(chǎn)物積累達(dá)到最高。,生長產(chǎn)量常數(shù)（Y，或生長得率）： 概念：表示微生物對(duì)基質(zhì)利用效率的高低

29、 Y=菌體干重/ 消耗營養(yǎng)物質(zhì)的濃度 根據(jù)產(chǎn)量常數(shù)可確定微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的需要量 。 如：Y=0.5，表示要得到5g菌體，需某營養(yǎng)物（葡萄糖）10g。,四、衰亡期,特點(diǎn)：①細(xì)胞死亡數(shù)增加，死亡數(shù)大大超過新增殖的細(xì)胞數(shù)，群體中的活菌數(shù)目急劇下降，出現(xiàn)所謂的負(fù)生長。②細(xì)胞內(nèi)顆粒更明顯，細(xì)胞出現(xiàn)多形態(tài)、畸形或衰退形，芽孢開始釋放。③因菌體本身產(chǎn)生的酶及代謝產(chǎn)物的作用，使菌體死亡、自溶等，發(fā)生自溶的菌生長曲線表現(xiàn)

30、為向下跌落的趨勢(shì)。 衰亡期比其他各時(shí)期時(shí)間長，它的長短也與菌種和環(huán)境條件有關(guān)。,產(chǎn)生原因：生長條件的進(jìn)一步惡化，使細(xì)胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導(dǎo)致菌體的死亡。微生物生長與代謝產(chǎn)物形成的關(guān)系：,微生物發(fā)酵形成產(chǎn)物的過程與微生物細(xì)胞生長的過程并不總是一致的。一般認(rèn)為：,初級(jí)代謝是給予生物能量和生成中間產(chǎn)物的過程，初級(jí)代謝產(chǎn)物的形成往往與微生物細(xì)胞的形成過程同步，微生物生長的穩(wěn)定期是這些產(chǎn)物的最佳收獲時(shí)機(jī)；,次級(jí)代謝產(chǎn)物與微

31、生物的生存、生長和繁殖無關(guān)。次級(jí)代謝產(chǎn)物的形成往往與微生物細(xì)胞的形成過程不同步。在分批培養(yǎng)中，它們的形成高峰往往在微生物生長穩(wěn)定期的后期或衰亡期。,主要的生長參數(shù),遲緩時(shí)間：實(shí)際達(dá)到對(duì)數(shù)生長期所需時(shí)間與理想條件下達(dá)到對(duì)數(shù)期所需時(shí)間之差。延緩生長量反映了遲緩期給細(xì)胞物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)造成的損失。比生長率：表示生長速度與生長基質(zhì)濃度之間的關(guān)系，當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)濃度很低時(shí)，比生長率與營養(yǎng)物質(zhì)濃度成正比?？偵L量：通過培養(yǎng)獲得的微生物總量與原來接種

32、的微生物量之差值。產(chǎn)量常數(shù)：總生長量與消耗基質(zhì)總量之比。,第三節(jié) 微生物的分離和純培養(yǎng),一、無菌技術(shù) 無菌技術(shù)：是將微生物分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)時(shí)防止被其它微生物污染的技術(shù)。 1、對(duì)使用的器皿及用具的滅菌 2、對(duì)培養(yǎng)基的滅菌 通常使用的方法有高溫蒸汽滅菌和高溫干熱滅菌，效果達(dá)到無菌（不含任何微生物)。,3、無菌的環(huán)境 （1）在操作過程中的無菌要求：接種、分離過程的無菌效果（在火焰上部進(jìn)行

33、操作）。 （2）在超凈工作臺(tái)、無菌室和無菌箱中進(jìn)行操作。使用甲醛、紫外線、75%的乙醇等進(jìn)行預(yù)處理及其他的必要措施。 （3）如進(jìn)行好氧培養(yǎng)需對(duì)空氣進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)室用多層紗布、棉塞和硅膠塞過濾空氣，工業(yè)中使用空氣過濾器過濾空氣。,二、微生物的分離方法 1、平皿劃線分離法,將滅好菌的瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，凝固后用接種針取少量的需分離菌，在培養(yǎng)基的表面上進(jìn)行劃線，經(jīng)培養(yǎng)后形成菌落。菌落在劃線開始處較密集，在劃線的結(jié)束處少，當(dāng)有單

34、個(gè)孤立的菌落時(shí)，就達(dá)到分離的目的。 劃線的方法有：連續(xù)劃線法、扇形劃線法、方格劃線法和平行劃線法。,特點(diǎn)：快速、方便。 分區(qū)劃線適用于濃度較大的樣品；連續(xù)劃線適用于濃度較小的樣品；,連續(xù)劃線,劃線分離后平板上顯示的菌落照片,2、稀釋分離法 （1）液體稀釋法,（1）液體稀釋法 首先將待分離的樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋,目的是得到高度稀釋的效果,使一支試管中分配不到一個(gè)微生物。如果經(jīng)過稀釋后的大多數(shù)試管中沒有微生物生

35、長,那么有微生物生長的試管得到的培養(yǎng)物可能就是由一個(gè)微生物個(gè)體繁殖而來的純培養(yǎng)物。 這種方法適合于細(xì)胞較大的微生物。,（2）稀釋倒平板法 首先將待分離的樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋，取一定稀釋度的樣品涂布平板或者取一定稀釋度的樣品和熔化的營養(yǎng)瓊脂混合（對(duì)于熱敏感菌不適用），培養(yǎng)到平板上長出單一的菌落。對(duì)于涂布平板的樣品菌落通常僅張?jiān)谄桨宓谋砻?，?duì)于與營養(yǎng)瓊脂混合的樣品菌落通常出現(xiàn)在平板的表面和內(nèi)部。,（3）涂布平板法

36、將經(jīng)過稀釋的樣品滴加入已制好并滅好菌的培養(yǎng)皿表面，用滅好菌的涂布棒將菌液均勻 的涂抹在整個(gè)平板上，經(jīng)培養(yǎng)長出單一菌落。具體分為兩種方法：將0.1ml樣品加入固體培養(yǎng)基表面，用無菌涂布棒均勻涂抹進(jìn)行培養(yǎng)（適用于某些嚴(yán)格好氧菌）或者將樣品加入到無菌的培養(yǎng)皿中，加入45~50 ℃固體培養(yǎng)基迅速混勻進(jìn)行培養(yǎng)。,3、單細(xì)胞（單孢子）挑取法,采用顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)的方法。該方法要在顯微鏡下進(jìn)行。

37、 毛細(xì)管法：用毛細(xì)管提取微生物個(gè)體，適合于較大微生物。 顯微操作儀：用顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個(gè)細(xì)胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。 小液滴法：將經(jīng)過適當(dāng)稀釋后的樣品制成小液滴，在顯微鏡下選取只含一個(gè)細(xì)胞的液滴來進(jìn)行純培養(yǎng)物的分離。,4、選擇性培養(yǎng)分離法,為了從混雜的微生物群體中分離出某種微生物，可以根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等，采用選擇培養(yǎng)的方法進(jìn)行分離。,利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行直接分離富集培養(yǎng),三、微生物的培養(yǎng)

38、 1、好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng) 好氧培養(yǎng)以空氣為氧的來源。實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)方法用平皿培養(yǎng)和斜面培養(yǎng)；工業(yè)生產(chǎn)時(shí)用自然對(duì)流和機(jī)械通風(fēng)法來供氧；液體培養(yǎng)時(shí)微生物利用培養(yǎng)液中的溶解氧；液體三角瓶培養(yǎng)時(shí)利用搖床機(jī)達(dá)到供氧的目的；發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)用通入無菌壓縮空氣達(dá)到供氧的目的。,厭氧培養(yǎng)是通過隔絕空氣或驅(qū)除氧氣的方法來實(shí)現(xiàn)的。實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)時(shí)，可將菌種接種到固體、半固體培養(yǎng)基的深層進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)加入還原劑；也可將厭氧微生物放入真空干燥器，抽出空氣

39、，并充入氮?dú)饣虻獨(dú)夂投趸嫉幕旌蠚怏w。,2、分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng) 分批培養(yǎng)：將微生物置于一定容積的、定量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基一次性加入，不再補(bǔ)充和更換，最后一次性收獲。分批培養(yǎng)的過程中菌體、各種代謝產(chǎn)物的數(shù)目與營養(yǎng)物的數(shù)目呈負(fù)相關(guān)性。當(dāng)微生物生長及基質(zhì)變化達(dá)到一定時(shí)，菌體生長則會(huì)停止。在發(fā)酵工業(yè)中可用中間補(bǔ)料或連續(xù)流加物料，使培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度保持在適合菌體生長和有利于菌體積累代謝產(chǎn)物的環(huán)境中。,連續(xù)培養(yǎng)：在微生物培養(yǎng)的過

40、程中，不斷地供給新鮮的營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)排除含菌體及代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液，讓培養(yǎng)的微生物長時(shí)間地處于對(duì)數(shù)生長期，以利于微生物的增殖速度和代謝活性處于某種穩(wěn)定狀態(tài)。 連續(xù)培養(yǎng)理論基礎(chǔ)：由于對(duì)典型生長曲線中穩(wěn)定期到來原因的認(rèn)識(shí)，采取相應(yīng)有效措施推遲其來臨，從而發(fā)展出現(xiàn)在的連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)。,連續(xù)培養(yǎng)原理,當(dāng)微生物在單批培養(yǎng)方式下生長達(dá)到對(duì)數(shù)期后期時(shí)，一方面以一定的速度流進(jìn)新鮮培養(yǎng)基并攪拌，另一方面以溢流方式流出培養(yǎng)液，使培養(yǎng)物達(dá)到動(dòng)態(tài)平

41、衡，其中的微生物就能長期保持對(duì)數(shù)期的平衡生長狀態(tài)和穩(wěn)定的生長速率。,連續(xù)培養(yǎng)和單批培養(yǎng)的比較,連續(xù)培養(yǎng)器,連續(xù)培養(yǎng)器,按控制方式分按培養(yǎng)器的級(jí)數(shù)分按細(xì)胞狀態(tài)分按用途分,,內(nèi)控制（控制菌體密度）：恒濁器外控制（控制培養(yǎng)液流速、以控制生長速率）：恒化器,單級(jí)連續(xù)培養(yǎng)器多級(jí)連續(xù)培養(yǎng)器,一般連續(xù)培養(yǎng)器固定化細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)器,實(shí)驗(yàn)室科研用：連續(xù)培養(yǎng)器發(fā)酵生產(chǎn)用：連續(xù)發(fā)酵罐,,,,,連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)——恒化連續(xù)培養(yǎng),概念：以恒

42、定流速使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)濃度恒定而保持細(xì)菌生長速率恒定的方法。 原理：通過控制某一種營養(yǎng)物濃度（如碳、氮源、生長因子等） ，使其始終成為生長限制因子，而達(dá)到控制培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率條件下進(jìn)行生長繁殖。特點(diǎn)：維持營養(yǎng)成分的亞適量，控制微生物生長速率。菌體生長速率恒定，菌體均一、密度穩(wěn)定，產(chǎn)量低于最高菌體產(chǎn)量。應(yīng)用范圍：實(shí)驗(yàn)室科學(xué)研究。,恒化器,連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)——恒濁培養(yǎng),概念：通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基流速，使培養(yǎng)液濁度

43、保持恒定的連續(xù)培養(yǎng)方法。原理：通過調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入的速度和培養(yǎng)物流出的速度來維持菌濃度不變,即濁度不變。主要采用恒濁器，當(dāng)濁度高時(shí)，使新鮮培養(yǎng)基的流速加快，濁度降低，則減慢培養(yǎng)基的流速。,連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)——恒濁培養(yǎng),特點(diǎn)：基質(zhì)過量，微生物始終以最高速率進(jìn)行生長，并可在允許范圍內(nèi)控制不同的菌體密度；但工藝復(fù)雜，煩瑣。,使用范圍：用于生產(chǎn)大量菌體、生產(chǎn)與菌體生長相平行的某些代謝產(chǎn)物，如乳酸、乙醇等。,恒濁器與恒化器的比較,連續(xù)發(fā)酵,連續(xù)培

44、養(yǎng)在生產(chǎn)上的應(yīng)用，相對(duì)于單批發(fā)酵而言。優(yōu)點(diǎn)： 高效，簡化了操作了裝料、滅菌、出料、清洗發(fā)酵罐等單元操作； 自控：便于利用各種儀表進(jìn)行自動(dòng)控制；產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定 節(jié)約大量動(dòng)力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、電的負(fù)荷均衡合理。,連續(xù)發(fā)酵 缺點(diǎn)：菌種易于退化；易于遭到雜菌污染；營養(yǎng)物利用率低于單批培養(yǎng)。 連續(xù)發(fā)酵的生產(chǎn)時(shí)間受以上因素限制，一般只能維持?jǐn)?shù)月~ 1年。,固定化細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng) 細(xì)胞固定化是