微生物的純培養(yǎng)及顯微技術(shù)

1、Chapter 2 微生物的純培養(yǎng) 及顯微技術(shù),Sect 1 微生物的分離和純培養(yǎng),一、前言二、微生物操作基本技術(shù)——無菌技術(shù)三、微生物的分離和純培養(yǎng)四、微生物的保藏技術(shù),一、前言,1、 微生物研究對象：群體2、研究基礎(chǔ)： 1）純培養(yǎng)技術(shù)：把特定的微生物從自然界混雜存在的狀態(tài)中分離、純化出來的技術(shù)。 ● 培養(yǎng)物： 在人為規(guī)定的條件下培養(yǎng)、繁殖得到的微生物群

2、體稱為培養(yǎng)物。 ● 純培養(yǎng)物：只有一種微生物的培養(yǎng)物。 2）顯微技術(shù)：包括顯微標(biāo)本的制作、觀察、測定、分析和記錄。,培養(yǎng)基,二、微生物操作基本技術(shù)——無菌技術(shù),1、微生物培養(yǎng)的常用器具及其滅菌1）常用器具：試管、玻璃燒瓶、平皿、接種環(huán)（針）、無菌操作臺、酒精燈等2）滅菌： ●滅菌(sterilization)：殺滅物體上所有微生物的方法。即采用強(qiáng)烈的理化因素使任何物體內(nèi)、外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失

3、其生長繁殖能力的措施。它比消毒要求高，包括殺滅細(xì)菌芽胞在內(nèi)的全部病原微生物和非病原微生物。如高溫、輻射、超聲波和激光等。,●消毒(disinfection)：殺死物體上病原微生物的方法，并不一定能殺死含芽胞的細(xì)菌或非病原微生物。即僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的病原菌，而對被消毒的生物基本無害的措施用以消毒的藥品稱為消毒劑(disinfectant）●抑菌(bacteriostasis)：抑制體內(nèi)或體外細(xì)菌的生長繁

4、殖。常用的抑菌劑為各種抗生素?！穹栏?antisepsis)：利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長繁殖而對被消毒的物體基本無害的措施。如低溫、缺氧、干燥、高酸、高滲或防腐劑。細(xì)菌一般不死亡。●無菌(asepsis)：不存在活菌。,（1）常用物理消毒滅菌方法 ● 熱力滅菌法； ● 輻射殺菌法； ● 濾過除菌法； ●超聲波殺菌法。,A、 熱力滅菌法 ●干熱滅菌法 ▲焚燒：廢棄物、尸體

5、； ▲灼燒：接種環(huán)、試管口； ▲干烤：玻璃器皿； ▲紅外線：醫(yī)療器械。 ● 濕熱滅菌法 Ⅰ）常壓下： ●巴氏消毒法：61.6-62.8 ℃30min或71.7 ℃15-30s,主要用于牛乳消毒。 ● 煮沸法；,巴氏消毒的方法有幾種？,一種是將牛奶加熱到62-65℃，保持30分鐘。這種方法目前在廣東較少使用。采用這一方法，可殺死牛奶中各種生長型致病菌，滅菌效率可達(dá)97.3%-99

6、.9%，經(jīng)消毒后殘留的只是部分嗜熱菌及耐熱性菌以及芽孢等，但這些細(xì)菌占多數(shù)的是乳酸菌，乳酸菌不但對人無害反而有益健康。第二種方法將牛奶加熱到75-90℃，保溫15-16秒，其殺菌時間更短，工作效率更高。但殺菌的基本原則是，能將病原菌殺死即可，溫度太高反而會有較多的營養(yǎng)損失。,●間歇蒸汽消毒法：80-100 ℃ 15-60 min,37 ℃過夜，循環(huán)三次。主要適用于不耐熱培養(yǎng)基滅菌。Ⅱ）加壓下：● 連續(xù)加壓滅菌：135-140

7、 ℃下處理5-15 s ，主要適用于大規(guī)模的發(fā)酵工廠培養(yǎng)基滅菌；● 常規(guī)加壓滅菌：121 ℃（壓力：1kg/cm2 或15 磅/英寸）15~20 min，是一種最為廣泛的滅菌方法。 ▲ 注意滅菌物體含菌量的影響，含菌量越高滅菌時間越長。 天然原料＞化學(xué)試劑 ▲ 空氣的排除程度，必須盡量驅(qū)盡鍋內(nèi)空氣。是依靠溫度而不是壓力來達(dá)到滅菌的目的。 15 磅/英寸：純蒸汽 121 ℃；排除1/2 空氣：112 ℃

8、； 不排除空氣： 100 ℃。,滅菌鍋,▲ 滅菌對象體積；50 ml (12min), 2000ml (30min) ▲ 滅菌對象pH值： pH＜6.0 最易死亡；而pH6.0~8.0時，微生 物最不易死亡。 ▲ 加熱與散熱的速度。 B、 輻射殺菌法； ● 紫外線：波長200-300nm的紫外線具有殺菌作用。其主要作用于DNA，使一條DNA鏈上相鄰的兩

9、個胸腺嘧啶共價結(jié)合形成二聚體，導(dǎo)致細(xì)菌變異和死亡。 ●電離輻射： 高速電子、X射線、γ射線,潔凈工作臺,● 微波：波長1mm~1m,C、過濾除菌法 ● 賽氏濾器； ● 玻璃濾器； ● 薄膜濾器 D、超聲波殺菌法 ● 是一種機(jī)械的作用因素，每秒超過2萬次振動的聲波即為超聲波。常用的超聲波發(fā)生器能產(chǎn)生20-100千赫的聲波?？墒辜?xì)菌細(xì)胞壁裂解而死亡。,超聲儀,（2）化學(xué)

10、消毒劑： ● 消毒劑的種類：酚類、醇類、重金屬鹽類、氧化劑、 表面活性劑、烷化劑。 ● 消毒劑的應(yīng)用：病人排泄物與分泌物、皮膚、粘膜、飲水、廁所、空氣、手。,3）接種操作 ● 用接種環(huán)或接種針分離分離微生物或在無菌條件下把微生物由一個培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)接到另一個培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)。,圖-2-1 無菌操作轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物 無菌操作箱紫外照射30min以上； 靠近火焰。,三、微生物的分離和純

11、培養(yǎng),● 菌落：單個微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長繁殖到一定程度可以形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞生長群體，稱為菌落?！窬Γ涸S多菌落連成一片稱為菌苔?！衽囵B(yǎng)基：培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)物質(zhì)。常用的有：肉湯、LB培養(yǎng)基等?！窆腆w培養(yǎng)基：用瓊脂或其它凝膠物質(zhì)固化的培養(yǎng)基。常用1.5%瓊脂。●平板：即培養(yǎng)平板的簡稱，它是指熔化的固體培養(yǎng)基倒入平皿冷卻凝固后，盛有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿。,一）優(yōu)勢微生物分離純培養(yǎng)

12、,1、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng) ● 稀釋倒平板法 缺點(diǎn)：熱敏感細(xì)菌易死亡； 影響嚴(yán)格好氧菌的生長。 ● 涂布平板法 注意：平板不能太干也不能太濕，同時不能損壞平板。 ● 平板劃線分離法 ★ 扇形； ★ 連續(xù)劃線； ★ 方格劃線。 注意：不能損壞平板。 ● 稀釋搖管法 ★ 適宜于嚴(yán)格厭氧菌；★ 步驟同稀釋倒平板法。,滅菌液體石蠟何固體石蠟的混合物

13、,,2、用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng) ★ 適宜于不能在固體培養(yǎng)基上生長的微生物如一些細(xì)胞大 的細(xì) 菌、原生動物和藻類； ★ 最后一個稀釋度 95%表現(xiàn)為不生長。二）劣勢微生物分離純培養(yǎng) 1、 單細(xì)胞分離 ★必須借助于低倍顯微鏡（較大的微生物）或顯微操作儀 （較小的微生物）； ★對操作技術(shù)要求高，多限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究。,2、選擇培養(yǎng)分離,★ 適宜于從自然界中分離

14、、尋找有用的微生物或劣勢生長 微生物。1）利用選擇培養(yǎng)基直接分離 ● 原理：根據(jù)待分離微生物的特點(diǎn)選擇不同的培養(yǎng)條件。如 分離高溫菌，可在高溫條件下培養(yǎng)；分離某種抗生素的抗 性菌株可在加有抗生素的平板上分離。2）富集培養(yǎng) ● 原理：利用不同微生物間生命活動特點(diǎn)的不同，制定特定 的環(huán)境條件，使僅適應(yīng)于該條件的微生物生長（即抑制大 多數(shù)微生物的生長），從而使其在

15、群落中的數(shù)量大大增加， 進(jìn)而對其進(jìn)行分離。如分離降解對羥基苯甲酸的微生物配置 以對羥基苯甲酸為唯一碳源的培養(yǎng)基。,★ 富集培養(yǎng)是分離微生物最強(qiáng)有力的手段之一。它可以用來 分離培養(yǎng)出由科學(xué)家設(shè)計(jì)的特定環(huán)境中能生長的微生物。,三） 二元培養(yǎng)物分離,● 二元培養(yǎng)物：如果培養(yǎng)物中只含兩種微生物，而且有意識 地保持其二者之間特定關(guān)系的培養(yǎng)物稱為二元培養(yǎng)物。 ★ 適宜于不能或很

16、難得到純培養(yǎng)的微生物。 ★ 如病毒是二元培養(yǎng)物保存的最有效途徑，因?yàn)椴《臼羌?xì)胞 生物的嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生物。四）不同的微生物有不同的最適方法，在實(shí)踐中根據(jù)需要采取其 最適方法。,四、微生物的保藏技術(shù),1） 目的：為了保證微生物研究和應(yīng)用工作的順利進(jìn)行，通過分離純化的微生物必須通過各種保藏技術(shù)保藏。2） 要求：不死；不被污染；不變異。3） 原理：根據(jù)菌種特性及保藏

17、目的的不同，給微生物以特定的條件，使其存活而得以延續(xù)。 A： 利用培養(yǎng)基或宿主對微生物菌株進(jìn)行連續(xù)接種； B：改變其所處的環(huán)境條件如干燥、低溫、缺氧等令菌株的代 謝水平降低，乃至完全停止，達(dá)到半休眠或完全休眠的狀 態(tài)，使其在一定時間內(nèi)得以保存。,4）保藏方法（1） 傳代培養(yǎng)保藏 ● 類型：瓊脂斜面、半固體瓊脂柱及液體培養(yǎng)基 ● 注意：A， 在規(guī)定時

18、間內(nèi)接種（一般1個月） B， 降低培養(yǎng)物的代謝或防止培養(yǎng)物干燥可延長傳代 保藏的時間。 ● 優(yōu)點(diǎn)：使用方便。 ●缺點(diǎn)： ★工作繁瑣 ； ★ 容易污染； ★ 易導(dǎo)致菌種的衰退。,（2）冷凍保藏 ● 原理：將微生物處于冷凍狀態(tài)使其代謝作用停止以達(dá)到保

19、 藏的目的（降低溫度）。 ● 方法： ★ 液氮 （-196℃）； ★ -70 ℃低溫冰箱； ★ -20 ℃普通冰箱 （溫度越低越好） ● 注意：盡量減小冰晶對細(xì)胞（主要是細(xì)胞膜）的損傷。 ★ 速凍； ★ 快速升溫； ★ 加保護(hù)劑如甘油（可加到15-50%），二甲亞砜。,

20、液氮罐,（3）干燥保藏法 ● 原理：干燥使其代謝停止（減少水分）。 ● 方法： ★ 沙土管保存：適用于產(chǎn)孢子的微生物如芽孢桿菌、放線菌等。 特點(diǎn)：簡便易行，并可以將微生物長期保藏。適合于一般實(shí)驗(yàn)室及以放線菌等為菌種的發(fā)酵工廠采用。 ★ 冷凍真空干燥保存：冷凍干燥樣品在真空或惰性氣體密閉環(huán)境中保存，使其生命活動處于休

21、眠，可以達(dá)到長期保存的目的。 特點(diǎn)：用冰升華除去水分手段比較溫和，細(xì)胞受損傷的程度相對較小，存活率及保藏效果不錯，同時郵寄和使用方便。它是目前使用最普遍、也是最重要的的微生物保藏方法。,（4）其它方法 ● 各種微生物保藏的方法還很多，如紙片保藏、薄膜保藏、寄主保藏等。 總之 ● 不同的微生物對不同保藏方法有不同的適應(yīng)性，迄今還沒有一種方

22、法被證明對所有的微生物都適應(yīng)。 ● 對于一些比較重要的微生物菌株，則要盡可能多的采用各種不同的手段進(jìn)行保藏，以免因某種方法失敗而導(dǎo)致菌種的喪失。,Sect 2 顯微鏡和顯微技術(shù),一、顯微鏡的種類及其原理一）光學(xué)顯微鏡 1、普通光學(xué)顯微鏡（light microscope) ● 適于觀察染色的標(biāo)本 2、暗視野顯微鏡 （dark-field m

23、icroscope) ● 適于觀察細(xì)菌的運(yùn)動性 3、相差顯微鏡 （phase contrast microscope),,● 通過特殊的光學(xué)裝置——環(huán)狀光闌和相差板，利用光的的干涉現(xiàn)象，將光的相位差轉(zhuǎn)變成肉眼可以覺察的振幅差（明暗差），從而使原來透明的物體表現(xiàn)出明顯的明暗差異，對比度增強(qiáng)。● 適于觀察不染色的活細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的某些細(xì)微結(jié)構(gòu)。,4、熒光顯微鏡（fluorescence microscop

24、e) ● 原理：是紫外線、熒光素（如FITC）、抗體分子（必要時）一起工作的顯微鏡。標(biāo)本用用熒光素覆蓋，紫外線直接照射標(biāo)本。紫外線將熒光染料中的電子激發(fā)，使之呈高能量水平。然后電子返回到它們初發(fā)的能量水平時，通過發(fā)射不同顏色的光來釋放額外的能量。 ● 在免疫學(xué)、環(huán)境微生物學(xué)、分子生物學(xué)中應(yīng)用十分普遍如抗原組織定位等。,普通光學(xué)顯微鏡的分辨率為0.25um。一般細(xì)菌都大于0.25um，故可用普通光學(xué)顯微鏡觀

25、察。,暗視野顯微鏡,,相差顯微鏡,,熒光顯微鏡,,（一）形態(tài)和染色,球 狀,桿 狀,螺旋狀,,基本形態(tài),一、細(xì)胞的形態(tài)構(gòu)造及其功能,（一）形態(tài)和染色,1、球狀,細(xì)胞個體呈球形或橢圓形，不同種的球菌在細(xì)胞分裂時會形成不同的空間排列方式，常被作為分類依據(jù)。,一、細(xì)胞的形態(tài)構(gòu)造及其功能,（一）形態(tài)和染色,2、桿狀,細(xì)胞呈桿狀或圓柱形，一般其粗細(xì)（直徑）比較穩(wěn)定，而長度則常因培養(yǎng)時間、培養(yǎng)條件不同而有較大變化。,枯草芽孢桿菌,地衣芽孢桿菌

26、,銅綠假單胞菌（綠膿桿菌）,結(jié)核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis,炭疽病的病原菌 -------炭疽桿菌,破傷風(fēng)梭菌,一、細(xì)胞的形態(tài)構(gòu)造及其功能,（一）形態(tài)和染色,3、螺旋狀,弧菌,螺旋菌,螺旋體菌,弧菌：,菌體只有一個彎曲，其程度不足一圈，形似“C”字或逗號，鞭毛偏端生。,蛭弧菌,霍亂弧菌,螺旋菌：,菌體回轉(zhuǎn)如螺旋，螺旋數(shù)目和螺距大小因種而異。鞭毛二端生細(xì)胞壁堅(jiān)韌，菌體較硬。,螺旋體菌：

27、,菌體柔軟，用于運(yùn)動的類似鞭毛的軸絲位于細(xì)胞外鞘內(nèi)。,梅毒密螺旋體,個體小:,測量單位：微米或鈉米,火星隕石中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌化石,（直徑 10 nm）,德國科學(xué)家H. N. Schulz等2019年在納米比亞海岸的海底沉積物中發(fā)現(xiàn)的一種硫磺細(xì)菌 (sulfur bacterium),其大小可達(dá)0.75 mm，Thiomargarita namibiensis,---“納米比亞硫磺珍珠”,二）、電子顯微鏡,1、 透射電子顯微鏡（tran

28、smission electron microscope, TEM) ● 原理：用一束電子作為它的能源，電子的波長很短，能夠檢測極細(xì)微的物體，如病毒和分子。 ● 應(yīng)用：通過細(xì)胞超薄切片，觀察細(xì)胞內(nèi)部的詳細(xì)結(jié)構(gòu)如細(xì)胞膜、細(xì)胞核等。（可放大幾萬倍）2、 掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope, SEM) ● 原理：類似于電視或電傳真照片。即利用電子“探針”

29、，在樣品表面進(jìn)行“掃描”，激發(fā)樣品表面放出二次電子，二次電子由探測器收集，并轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘枴?● 應(yīng)用：觀察微生物表面結(jié)構(gòu)。 （可放大幾十萬倍）,電子顯微鏡的分辨率為1nm。不僅能看清細(xì)菌的外形，內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)可一覽無余。,透射電鏡,掃描電鏡,3、掃描隧道顯微鏡（scanning tunneling microscope, STM),●原理：利用量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)。即運(yùn)用極細(xì)的金屬探針（小到只有一個原子）在物體表面近距

30、離（0.5~2nm)掃描，通過 隧道電流變化了解樣品表面形貌。 ●特點(diǎn)： ★ 分辨率高（橫向達(dá)0.1~0.2nm,縱向達(dá) 0.001nm），是目前分辨率最高的顯微鏡； ★ 可以避免樣品變形（不接觸樣品，無高能量電子襲擊） ★ 可以在保持樣品生理?xiàng)l件的大氣壓及液體環(huán)境下工作。 ● 應(yīng)用：十分廣泛，目前人們運(yùn)用STM直接觀察到DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物大

31、分子，及生物膜、病毒等的結(jié)構(gòu)。,掃描隧道顯微鏡,,4、原子力顯微鏡（atomic force microscope, AFM),● 原理：類似于STM，但不是通過隧道電流，而是通過一個激光裝置來監(jiān)測，探針隨樣品表面的升降變化來獲取樣品表面形貌的信息。 ●適于不導(dǎo)電的或?qū)щ娔芰懿畹臉悠贰６?、顯微鏡樣品的制備 1、光學(xué)顯微鏡的制樣：★ 活體觀察； ★ 染色觀察2、