《中國藥典》薄層色譜的基本要求

1、《中國藥典》薄層色譜的基本要求,周蘭貴州省食品藥品檢驗所中藥（民族藥）室 2014年5月,內(nèi)容,薄層色譜技術(shù)在中藥標準的優(yōu)勢《中國藥典》薄層色譜的基本要求薄層色譜應用的影響因素,薄層色譜技術(shù)在中藥標準的優(yōu)勢,薄層色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B），系將供試品溶液點于薄層板上，在展開容器內(nèi)用展開劑展開，使供試品所含成分分離，將所得色譜圖與對照物按同法所得的色譜圖比較，并可用薄層掃描儀進行掃描，用于鑒別、檢查或含量

2、測定的方法。,薄層色譜技術(shù)在中藥標準的優(yōu)勢,薄層色譜獨有的特點是分析結(jié)果以直觀的彩色圖像表達，為其它色譜技術(shù)所不能。而圖像給出的多層面的信息是文字難以表達的，而且豐富多彩的圖像可以給分析者更多的思考判斷的空間。,提供直觀的彩色圖像是薄層色譜獨有的特點,離線操作的靈活性,各單元操作既有關(guān)聯(lián)，又相互獨立，點樣器材和方法、展開方式、顯色試劑選擇、直觀比較或掃描比較可根據(jù)需要靈活變通。根據(jù)需要操作可以視實際需要和實驗室條件分層次進行和終止，節(jié)省

3、分析時間和資源。由于是離線操作，所以個人占機時間短。,正相色譜流動相（展開劑）的廣泛適用性,薄層色譜最常用的是以硅膠板為基礎固定相的正相色譜，有多種組合的有機溶劑展開系統(tǒng)可供選擇；甲苯系統(tǒng)；三氯甲烷系統(tǒng)；己烷系統(tǒng)；正丁醇系統(tǒng)；乙酸乙酯系統(tǒng)等等。酸性、堿性、中性。高極性、中等極性、低極性。,色譜后衍生的專屬性,色譜后靈活方便的衍生技術(shù)，同一色譜薄層板可生成可見光譜、紫外光譜、熒光淬滅光譜或熒光光譜，給出豐富的檢測成分的化學類別信息

4、。如三氯化鋁試劑是黃酮類化合物的專屬試劑；碘化鉍鉀是生物堿類成分的專屬試劑；三氯化鐵是酚類成分的專屬試劑；醋酐硫酸是三萜類和甾醇類成分的專屬試劑等。硫酸則是許多成分激發(fā)產(chǎn)生熒光的通用試劑，非常方便。,同板多個樣品平行比較,成本相對低廉、色譜生成快速、同板可以同時產(chǎn)生多達16~18個樣品色譜，共平行直觀地比較，色彩豐富的圖像給人的視覺沖擊遠遠大于較為“呆板”的輪廓色譜圖，可以迅速地、粗略地，而且頗為有效地評價樣品色譜圖像之間的相試程度。,

5、《中國藥典》薄層色譜的基本要求,供起草標準用樣品的要求,中成藥薄層色譜鑒別,中藥材薄層色譜鑒別,中藥標準制定技術(shù)要求,,原則,保證用藥安全,科學、先進、規(guī)范、適用,促進標準國際化,中藥標準制定技術(shù)要求,,中藥標準制定《國家藥品標準工作手冊》中藥質(zhì)量標準 研究制定技術(shù)要求,方法學驗證 中藥質(zhì)量標準方法學驗證指導原則（中國藥典2010版一部）,供起草用樣品的要求,,研究用樣品應具有代表性，覆蓋面要廣，一般至少收集15批以上

6、樣品供研究用；,對于多來源品種，每種收集3~5種；相關(guān)信息包括：產(chǎn)地（如有可能表明野生或家種）、收集地、收集時間、收集人,獨家生產(chǎn)的應不少于10批，多家企業(yè)生產(chǎn)的應盡量收集每家企業(yè)的樣品，5家以上企業(yè)生產(chǎn)的應至少收集5~10家企業(yè)生產(chǎn)的樣品,樣品量除滿足起草研究、留樣觀察外，還應有不少于3倍檢驗量的樣品供復核用,,,供起草用樣品的要求,,注意,中藥材、飲片要求專家鑒定,對于具有多種不同規(guī)格的中成藥，應收齊全部規(guī)格的樣品,試驗用樣

7、品必須采用合格原輔料依法生產(chǎn)的樣品，收集的每批樣品均要有該企業(yè)的原輔料和成品的自檢報告及詳細生產(chǎn)工藝,供起草用樣品的要求,,陰性對照樣品,生產(chǎn)單位應盡可能提供,研究單位自制,陰性樣品系指按處方除去被測定的藥味，按制法制備的樣品，注意應包括所有的輔料和工藝步驟，制成量應與原標準相符,,,鑒別,,,鑒別,顯微鑒別,理化鑒別,色譜鑒別,特征圖譜鑒別,一般理化鑒別,熒光鑒別,光譜鑒別,薄層色譜鑒別,液相色譜鑒別,氣相色譜鑒別,,,,中藥材

8、薄層色譜鑒別,,盡量采用對照品和對照提取物或?qū)φ账幉耐瑫r進行對照,圖譜清晰、斑點明顯、分離度與重現(xiàn)性符合要求,根據(jù)被測物的特性選擇合適的固定相、展開劑及顯色方法等色譜條件,色譜條件的優(yōu)化應對三個以上的展開系統(tǒng)進行考察,確定供試品取樣量、提取和純化方法、點樣量等條件,選擇合適的對照物質(zhì)，確定對照物質(zhì)用量、濃度、溶劑、點樣量等,,,,中藥材薄層色譜鑒別,驗證,專屬性,重復性,耐用性,重現(xiàn)性,多來源藥材、飲片的色譜行為是否一致混淆品的

9、區(qū)別斑點是否重疊,不同品牌的薄層板或自制薄層板考察考察至少2~3個品牌或廠家的薄層板，,不同溫度、濕度考察，在5℃~35℃考察高低2個溫度；在低相對濕度（RH）15~30%和高相對濕度75~90%各考察一個相對濕度,,,,,中成藥薄層色譜鑒別,（1）薄層色譜具有分離與鑒別的特性，并具有直觀、承載信息大、專屬性強、快速、經(jīng)濟、操作簡便等優(yōu)點，是中成藥鑒別的首選方法。,（2）新建立的薄層色譜應該圖譜清晰，斑點明顯，分離度、專

10、屬性、重現(xiàn)性與耐用性符合要求，并需要提供圖譜；,（3）應盡量與該藥材和飲片的薄層色譜鑒別方法一致，如因其他成分干擾或制劑的提取方法不同，可增加提取純化處理或展開劑優(yōu)化。,新增薄層色譜鑒別要求,,供試品溶液的制備：應盡可能除去干擾，同時方法盡量簡便，首先進行提取、純化選擇，如回流、超聲提取方法，溶劑、時間，酸堿處理，溶劑萃取，柱子純化等的選擇,對照品選擇：盡量采用以對照品和對照提取物或?qū)φ账幉耐瑫r進行對照。當對照品不易獲得時，可采

11、用對照提取物或?qū)φ账幉臑閷φ?薄層板的選擇：吸附劑的比較，選硅膠G板還是GF254板,,新增薄層色譜鑒別要求,點樣量選擇：不同點樣量的比較,展開劑選擇：對三個以上的展開系統(tǒng)進行考察比較,顯色條件選擇：日光、紫外光、顯色劑,陰性空白試驗：以證明其他藥味無干擾,耐用性：不同廠牌的薄層板、溫度、相對濕度等,注意,（1）使用對照藥材應保證藥材的主斑點在樣品中均有對應斑點（可參照制法對藥材進行前處理），供試品色譜中不能只有對照藥材色譜中的1~

12、2個次要斑點相對應,（2）盡可能采取一個供試液多項多維鑒別使用的薄層色譜方法，達到節(jié)約資源、保護環(huán)境、簡便實用的目的,（3）注意”過柱“的影響，不同品牌、不同批號的吸附劑吸附能力有的不同,（4）對原方法的驗證注意原標準點樣量按手鋪板制定，現(xiàn)用市售薄層板點樣量過大分離度差，點樣量可減少,薄層色譜應用的影響因素,樣品預處理薄層色譜的點樣技術(shù)吸附劑活性溶劑蒸汽在薄層色譜中的應用溫濕度對薄層色譜的影響薄層色譜的優(yōu)化及溶劑系統(tǒng)（展開

13、劑）的選擇薄層板,樣品預處理,要得到一個較為清晰的色譜，樣品提取物經(jīng)預處理，使供試品溶液得以凈化，往往是一個重要的有時甚至是關(guān)鍵的步驟提取溶劑的要求：溶解度不宜太大，黏度不宜太高，沸點適中,供試品溶液凈化的方法,（1）單一溶劑提取法 根據(jù)被測物質(zhì)的化學特性，有選擇性地采用某種溶劑直接提取制備。（如浙貝母、平貝母、華山參、洋金花等）（2）分段提取法； 被檢測樣品不同極性部位分別提取后制成相應供試液，分別檢測分析（如丹參）

14、（3）特殊提取方式 如蜜丸等含糖較高又有黏性的樣品，有機溶劑較難滲透到樣品的內(nèi)部，可加硅藻土、滑石粉等分散劑共同研勻后再提取。,供試品溶液凈化的方法,（4）液-液萃取法 利用樣品與雜質(zhì)在兩相（水相和有機相）中溶解度的不同，達到凈化目的。 特別適合合劑、口服液、糖漿劑、注射劑等的處理。（5）固-液萃取法 固相小柱萃取基本上是基于吸附、鍵合相分配、正相、反相、離子對、離子交換原理富集待測成分，去除部分雜質(zhì)。,點

15、樣,點狀或條帶狀點樣？ 點狀點樣： 簡單快速 缺點：接觸式點樣，易損傷薄層板表面 點樣量小 斑點容易點大，易產(chǎn)生容積環(huán)形色譜效應，影響 分離效果 條帶狀點樣 優(yōu)點：一般噴霧式，不損傷薄層板表面 點樣量比點狀點樣大 原點不會上下擴散，分離度增加,點樣,點多少？ 常規(guī)的TLC：0.5-5μl， 高效TLC：HPTLC： ＜ 1μ

16、l；用什么點？ 常規(guī)：手工一般使用定量毛細管（0.5/1/2和5μl），點樣是毛細管必須完全充滿和完全排空，要以垂直方向小心接觸TLC/ HPTLC板面，（玻璃毛細管不易損傷預制板的板面），切忌斑點或條帶在原點因溶劑過大造成原點的擴散，一般建議控制在5μl以下。 裝置：手工點樣器 半自動點樣器 全自動點樣器,展開-展開溶劑,使用的溶劑必須是“分析

17、純”或“色譜純”有毒試劑如“苯”禁用，“三氯甲烷”慎用（三氯甲烷目前仍有使用，否則許多鑒別無法進行，有的例子是難以取代的）；溶劑組成采用體積比（如乙酸乙酯-甲醇-甲酸=8:2:0.1，或?qū)懽?0:20:1 V/V/V)。甲酸一般雖然用量很微，但應準確加入。溶劑總量應足以使薄層板的浸入深度約為5mm（展開劑量的多少會影響斑點的Rf值）展開劑要求新鮮配制，一般不用多次反復使用，如展開溶劑混合放置后有分層現(xiàn)象，則按要求放置分層后取需

18、要的一相（上層或下層），備用。,展開-飽和與預平衡,溶劑的蒸氣相在展開缸中也參與色譜展開而形成三維的層析過程，即固相-板上的吸附劑、液相-展開劑、氣相-溶劑蒸氣三相相互作用；如處理不好，會產(chǎn)生如下現(xiàn)象： 展開過程中展開劑的組分被固定相分離產(chǎn)生第二前沿。 未平衡或平衡時間不夠易產(chǎn)生邊緣效應。,該怎樣飽和呢？,展開缸預平衡或飽和：展開前將展開劑置展開缸中，其蒸氣在展開缸中平衡一段時間（15-20min）后迅速放入薄層板展

19、開；預吸附：將薄層板放在展開缸中，不與展開劑接觸，吸附一定量的溶劑蒸氣可以改變層析行為，得到不同的色譜；,飽和方式,方法A（展開缸、薄層板均不飽和）方法B（展開缸飽和、薄層板不飽和）方法C（展開缸、薄層板均飽和）,展開-展開劑優(yōu)化,展開劑在色譜展開中起著關(guān)鍵作用，至今植物藥分析的薄層展開劑的優(yōu)化基本上還是依靠經(jīng)驗。主要是因為植物藥含有太多的未知成分，色譜行為各不相同，所以試錯法仍然是中藥分析實驗室在選擇展開劑時最常用的方法（包括借

20、鑒他人的經(jīng)驗）,展開劑的優(yōu)化,主要考慮兩方面：溶劑的極性和溶劑的選擇性。 前者要求使待分離的主要物質(zhì)的Rf值在0.3~0.7之間；當Rf值符合要求后，進行等強度溶劑替換，直到分離度達到要求為止。對于硅膠等吸附薄層和正相分配色譜來說，展開劑的極性越大，溶劑強度就越大，洗脫能力就越強，即同一物質(zhì)在薄層板上的Rf值越大。根據(jù)文獻和樣品所含化合物類型選擇，并記錄色譜純?nèi)軇鰷p溶劑強度→混合，改性試劑，添加酸堿、水等→獲得最佳配比,

21、常用溶劑的極性順序,水（最大）＞ 甲酰胺＞乙腈＞甲醇＞乙醇 ＞丙醇＞丙酮＞二氧六環(huán)＞四氫呋喃＞甲乙酮＞正丁醇＞乙酸乙酯＞乙醚＞異丙醚＞二氯甲烷＞三氯甲烷＞溴乙烷＞笨＞四氯化碳＞二硫化碳＞環(huán)己烷＞己烷＞煤油（最?。?展開-展開距離,是不是展距越大越好呢？ TLC:12-15cm HPTLC:5-7cm建議對展距進行考察，選擇最佳展距，并做好記錄,溫度對薄層色譜的影響,一般而言，溫度越低，Rf值越低；

22、展開溫度對薄層色譜的影響不大，一般相差±5℃時，Rf值的變動一般不會超過±0.02；因此，展開溫度一般控制在15~25 ℃之間即可（一般空調(diào)實驗室均能解決）；記錄試驗時的實際溫度。,相對濕度對薄層色譜的影響,一般而言，濕度越低， Rf值越低；相對濕度是影響薄層色譜重現(xiàn)性差的主要原因之一；不同樣品或成分和所選用的展開劑對相對濕度的適應能力不同；因此，建議展開的濕度一般控制在＜50%記錄試驗時實際的相對濕度

23、,相對濕度的控制方法,顯色,對同一薄層板在UV254、365nm、可見光（衍生前和/或后）下觀察——給出豐富的化學結(jié)構(gòu)類型信息；TLC板上常含有UV指示劑（F-254），在UV254nm激發(fā)下產(chǎn)生有色熒光。對UV254nm有吸收的物質(zhì)存在于斑點上時發(fā)射的熒光會減弱（熒光淬滅）；噴霧 優(yōu)點：快速、方便、試劑消耗少； 缺點：會產(chǎn)生有毒霧氣，重現(xiàn)性是個問題。浸漬 優(yōu)點：顯色均勻 缺點：試劑

24、消耗量大，產(chǎn)生溶劑線，背景染色深；,顯色劑考察,對顯色劑考察原則： 用對照品對照的樣品，通常選用針對對照品的專屬性顯色劑，如生物堿類藥材，選用改良碘化鉍鉀試液； 用對照藥材對照的樣品，通常選用顯色劑如10%硫酸乙醇溶液顯色；或選用針對該樣品活性成分或?qū)傩猿煞值膶傩燥@色劑。加熱顯色者須注意加熱的時間和溫度（做好時間和溫度的記錄）有的成分加試劑后，如揮發(fā)油成分經(jīng)香草醛硫酸顯色，加熱溫度和時間長短不同或放置時間不