體內(nèi)藥物分析方法及方法的設計與評價

1、體內(nèi)藥物分析 Biopharmaceutical Analysis,體內(nèi)藥物分析方法及方法的設計與評價,,生物樣本經(jīng)預處理后，選用適當方法進行測定?？晒┥矬w液中藥物及其代謝物含量測定的分析方法很多，歸納起來主要有三類：（一）光譜分析法 （二）免疫分析法 （三）色譜分析法,,除以上三類主要方法外，在生物藥物分析中有時還使用同位素標記藥物，它們主要應用于RIA、同位素逆稀釋分析，或作為GC-MS分析的內(nèi)標，以及在藥物分離中作示蹤應

2、用等。此外，還有一些含抗生素類藥物的生物樣品，它們可用微生物方法測定，利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴散作用，比較樣品與藥物標準品兩者對接種的試驗菌產(chǎn)生的抑菌圈的大小，借以測定樣品內(nèi)抗生素藥物的濃度。,（一） 光譜分析法,光譜分析法包括比色測定、紫外分光光度法和熒光分光光度法。光譜法在體內(nèi)藥物分析中是應用較早的方法之一，根據(jù)陸明廉對我國1975～1984年間血藥濃度測定方法的統(tǒng)計，應用光譜法占應用血藥分析方法總數(shù)的三分之一。雖然近十多年來

3、色譜法的飛速發(fā)展，使光譜法退出了體內(nèi)藥物分析應用方法的主角地位，但因其操作簡便、快速，在體內(nèi)藥物分析中仍占有一定的地位。,,由于光譜法不具備分離功能，選擇性較差，因此對樣品的預處理要求較高。選用專屬的方法或試劑與之反應，測定衍生物的熒光或?qū)馕諒姸?，也可借助?shù)學的方法消除干擾。,1、比色法,比色法靈敏度不高，通常只能測定出1ug/ml濃度以上的樣品。但該法具有快速，簡便，對儀器要求不高等特點。只要采用具有選擇性的顯色劑和反應條件，可不

4、經(jīng)分離提取等步驟，直接用于血藥濃度監(jiān)測。,2、紫外分光光度法,分光光度法的靈敏度較比色法高，適用于測定具有紫外吸收的藥物，方法簡單，儀器要求也不高。但用于測定含藥濃度低的樣品時，也受到一定的限制。如測定體液中藥物濃度時，亦可能受體液中內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾和影響。因此，本法在體內(nèi)藥物分析中也受到靈敏度和專一性的限制。但采用一些光譜分析技術(shù)，如用差示分光光度法，導數(shù)分光光度法，雙波長和三波長分光光度法等，可適當提高方法的靈敏度和選擇性，也可消除

5、雜質(zhì)的干擾，因此，該法目前仍用于一些生物樣品中的藥物檢測。,3、熒光分光光度法,熒光分光光度法的靈敏度比紫外-可見分光光度法的靈敏度高，最高可達到10-12g/mL，雖然有熒光的物質(zhì)數(shù)量不多，但體內(nèi)許多重要的生化物質(zhì)、藥物及其代謝物或致癌物都有熒光現(xiàn)象。由于熒光衍生物試劑的使用，進一步擴大了熒光分光光度法的應用，因此該法在體內(nèi)藥物分析和藥物動力學研究中得到廣泛的應用。,（二）免疫分析法,免疫分析主要指放射免疫、酶免疫、熒光免疫分析等。該

6、法的原理是利用抗原-抗體特異反應來測定體內(nèi)藥物的含量。該法具有靈敏度高、專一性強、操作簡便、快速等優(yōu)點，是臨床治療藥濃監(jiān)測和生化檢驗的常用方法，但需要一定的試劑盒和儀器。,(三)色譜分析法,色譜方法包括HPLC、GC和TLC等方法。色譜法在我國體內(nèi)藥物分析中的應用始于20世紀80年代，由于色譜法具有分離分析功能，具有高的專屬性和靈敏度，并能同時分離分析結(jié)構(gòu)相似的藥物和代謝物等優(yōu)點，使得其近20年來發(fā)展迅速，尤其是HPLC法，己在體內(nèi)藥物

7、分析領(lǐng)域中確立了主導地位，常用作體內(nèi)藥物分析中評價其他方法的參比方法。近年手性色譜技術(shù)、毛細管電泳技術(shù)、色譜與光譜聯(lián)用技術(shù)、色譜與免疫聯(lián)用技術(shù)等的建立與發(fā)展，更為色譜技術(shù)在體內(nèi)藥物分析中的應用增添了無量的前景。,1、HPLC法,HPLC法在體內(nèi)藥物分析中的應用已大大超過其他分析方法，成為體內(nèi)藥物分析中應用最廣泛的技術(shù)之一。與GC法相比，它具有以下優(yōu)點：(1)適用范圍廣，可在室溫下進行檢測。對于揮發(fā)性低的，熱穩(wěn)定性差的，分子量大的以及離

8、子型化合物等均可測定。,,(2)樣品預處理簡單，可不經(jīng)萃取和衍生化處理直接測定極性大的水溶性藥物，特別適合生物樣品的測定；(3)分離效率高，流動相選擇范圍廣，儀器自動化程度高。(4)檢測器多是針對整分子的光譜特征進行檢測的，專一性較高。檢測方法多采用非破壞性的。流出組分可回收，可用于樣品的制備。,2、GC法,GC法是最先興起的具有分離和分析兩種功能的測定技術(shù)，在藥物分析和體內(nèi)藥物分析中曾得到較廣泛的應用。由于HPLC法的發(fā)展，尤其是

9、RP-HPLC(反相-高效液相色譜法）的廣泛應用，使GC法的應用相對減少。其原因是GC法本身具有一些缺點，應用時常受被測組分的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性等方面的限制。用GC測定藥物時一般需要在120℃以上柱溫條件下進行，因此不適合用于遇熱不穩(wěn)定和極性大或揮發(fā)性差的藥物，不適合用于生物樣品的測定。因而影響該法在體內(nèi)藥物分析中的廣泛應用。,（四）毛細管電泳法,毛細管電泳法(CE)，又稱高效毛細管電泳法(HPCE)，是20世紀末發(fā)展起來的一種高效、快速

10、的分析技術(shù)。HPCE是以高電壓電場為驅(qū)動力，以毛細管為分離通道，依據(jù)樣品各組分之間淌度和分配系數(shù)的不同而實現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)。近年來HPCE發(fā)展十分迅速，已在化學、生命科學和藥學等領(lǐng)域得到廣泛的應用。,,由于該法具有高效、快速、靈敏、進樣少、信息量大、運行成本低、易于自動化等優(yōu)點。因此使其在體內(nèi)藥物分析及其代謝的檢測中得到廣泛的應用。根據(jù)HPCE法的分離模式的不同。HPCE又分為：毛細管區(qū)帶電泳、膠束電動毛細管色譜、毛細管凝膠

11、電泳、毛細管等電聚焦、毛細管等速電泳和毛細管電色譜法。上述這些方法近幾年來在體內(nèi)藥物分析中均得到不同程度應用。,,,,選用何種方法進行體內(nèi)藥物分析為好呢？一般要根據(jù)藥物的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)持征、藥物濃度大小、干擾成分的多少、預處理方法、實驗目的以及實驗室條件等因素綜合起來進行考慮。,分析方法的設定依據(jù),(一)做好文獻總結(jié)、整理工作對已有報道的藥物進行測定，應系統(tǒng)總結(jié)前人的文獻，從中找出哪些問題已解決，還存在哪些問題等。對尚無文獻報道的，也

12、可根據(jù)藥物的性質(zhì)情況，參考相似類型藥物的文獻資料。,(二)充分了解待測藥物的特性與體內(nèi)狀況,藥物的理化性質(zhì)和體內(nèi)過程是建立方法的主要依據(jù)。藥物的理化性質(zhì)包括酸堿性(pKa)、親脂性、溶解度、極性、光譜特征、穩(wěn)定性等，這些性質(zhì)與分析方法的選擇、實驗條件的改善密切相關(guān)。與常規(guī)分析方法不同，體內(nèi)藥物分析的對象是來自生物體內(nèi)的樣品，因此對藥物在體內(nèi)的狀況必須了解，如藥動學參數(shù)、體內(nèi)代謝情況等。這涉及樣品取樣頻率與間隔，分析方法的選擇等。,(三)

13、明確測定的目的、要求,應了解擬建立的方法是用于測定藥代動力學參數(shù)，還是用于臨床藥濃監(jiān)測。前者要求具有一定的靈敏度和準確度，不強調(diào)簡便、快速，設計方法時應考慮到不同時間獲得的樣品中藥物濃度變化較大這一因素。而用于臨床藥濃監(jiān)測，則要求方法簡便、快速。另外，是否要求同時測定母體藥物和代謝物，若需同時測定兩者，則應選擇具有分離能力或?qū)俚臏y定方法。,（四）結(jié)合實驗室條件,根據(jù)實驗室現(xiàn)有的和可能獲得的設備條件加以考慮，選擇可行的方法。,方法建立的

14、一般實驗步驟,方法初步擬定后，還需進行一系列實驗工作，以選擇最佳實驗條件及驗證所擬定的方法是否適合實樣檢測。通常包括下列步驟：（一）以純品進行測定取藥物或其代謝物純品適量，按擬定方法測定，求得濃度與測定響應值之間的關(guān)系，進行線性范圍、最適測定濃度、檢測靈敏度、測定最適條件(如pH值、溫度、反應時間等）等的選擇。,(二)空白樣品測定,取空白生物樣品，按擬定的方法進行處理，測定空白值(或色譜圖)?？瞻字蹈叩突蛏V圖狀況將影響到方法的靈敏

15、度和專屬性，應力求將空白值降低。在色譜分析中應力求減少體內(nèi)樣品中內(nèi)源性雜質(zhì)峰，對無法消除的內(nèi)源性雜質(zhì)峰應設法使其從待測物的色譜區(qū)域內(nèi)移開。能否取得良好的樣品空白實驗結(jié)果，是決定測定方法實際可行性的重要環(huán)節(jié)，必須設法解決。,(三)以水代替空白樣品，添加標準后測定,以水代替空白生物樣品，添加標準后按擬定的方法進行測定，以了解提取回收率及最低檢測濃度的大致情況，從而對萃取溶劑、pH值、揮發(fā)濃縮等條件進行選擇。,(四)空白樣品中添加標準后測定,

16、于空白生物樣品中添加一定量標準品后按擬定方法進行測定，求得樣品回收率數(shù)據(jù)，建立標準曲線。若采用色譜法測定，多數(shù)情況下需要用內(nèi)標法定量，則應首先選擇合適的內(nèi)標，然后進行回收率的測定。,(五)體內(nèi)實際樣品測定,經(jīng)過上述(一)至(四)步驟后進行實際樣品的測定。但要指出的是，以上步驟只是生物樣品實樣檢測前的準備工作，不能完全確定是否適用于實樣測定。因藥物在體內(nèi)變化是復雜的，如不注意藥物代謝和蛋白結(jié)合情況，則應用體外建立的方法，進行體內(nèi)實樣測定時

17、往往會失敗，甚至導致錯誤的結(jié)論，所以在設計方法時強調(diào)對藥物體內(nèi)過程要有一定程度的了解，從而選擇避免干擾和適合樣品實際情況的方法。有時也可采用專屬性強，已證明用于體內(nèi)實樣測定的步驟和方法作為對照測定，以此來檢驗所建立的方法的實際可行性。,方法的評價,對于所建立的體內(nèi)藥物分析方法的可行性與可靠性，需要應用若干標準來進行方法學的考察與評價。這是研究和建立一個新的分析方法時必須著重抓住的幾個環(huán)節(jié)。評價一個體內(nèi)藥物分析方法的優(yōu)劣主要有以下幾個指

18、標：精密度、準確度、靈敏度、專屬性或選擇性、可測濃度范圍、測定所需時間以及對生物樣品的適應性等，現(xiàn)擇要討論如下：,（一）準確度,準確度(accuracy)是方法評價的最基本要點之一，它是表示測定結(jié)果與真值的符合程度。常用回收率(recovery)數(shù)值反映測定的準確程度，也可通過與其他已建立的方法進行比較的辦法來加以反映。將已知量的藥物純品加到空白樣品(如血樣)中去，經(jīng)過一系列的處理、測定，所得藥物量與加入量之比值的百分率即為回收率。,

19、,回收率當然越接近100％越好，但因樣品組分復雜，含量低，處理步驟多時就很難達到高的回收率。對于一個方法來說，更為重要的是每次測定所得回收率要保持恒定，雖然有時回收率較低，但只要重現(xiàn)性好，通過校正后仍可采用。根據(jù)回收率測定方法不同可分為絕對回收率和方法回收率。,1．絕對回收率,絕對回收率也稱萃取回收率、提取回收率，它反映了一個方法的萃取效率，與體內(nèi)樣品檢測靈敏度有關(guān)，是評價體內(nèi)藥物分析方法的重要指標之一?，F(xiàn)以色譜法為例，說明絕對回收率

20、的求算過程。,,例如取一定量被測藥物標準品，加到空白血樣中，按規(guī)定方法處理，使最后溶液中藥物標準品濃度為1ug/mL，測定色譜峰面積，記為A測，另取1ug/mL的藥物標準品的純?nèi)軇┤芤阂私舆M樣，測得色譜峰面積記為A真，用外標法計算。,,絕對回收率應考察高、中、低3個濃度，低濃度選擇在定量限(LOQ)附近，高濃度在標準曲線的上限附近，中間選一個濃度。對于回收率的大小與變異不宜苛求，一般添加量在10-6～10-9級，絕對回收率若能達到50％

21、～80％，應認為是令人滿意的。,,在色譜分析中常采用內(nèi)標法測定含量，將藥物標準品和內(nèi)標準物質(zhì)加到空白血樣中，按規(guī)定方法處理，測得藥物和內(nèi)標峰面積，求出它們的比值R測＝A藥/A內(nèi)。另取相同濃度的藥物標準品和內(nèi)標準物質(zhì)的純?nèi)軇┤芤哼M樣，得藥物標準品和內(nèi)標峰面積，計算兩者的比值R真＝A'藥/A'內(nèi)。再根據(jù)下式求出回收率：,,在內(nèi)標法中，應注意藥物與內(nèi)標準物質(zhì)各自用外標法測得的絕對回收率應相近，兩者相差應小于10％，否則回收率偏

22、離100％太遠。,2．方法回收率,取一系列濃度的藥物標準品加到空白體液中，按設定方法測定，根據(jù)標準品濃度及響應的測定信號值繪制標準曲線，先按最小二乘法求出回歸方程。然后取高、中、低濃度的藥物標準品添加到空白體液中，每個濃度至少平行測定5份，按標準曲線制備方法同法測定，所得信號值代入回歸方程，求得測定值。最后與加入量比較，得方法回收率。除定量限外，各濃度點測得的平均值偏離實際加入量應小于15％，定量限這一點應小于20％。,,在測定回收率時

23、，不管采用何種方法，都要注意以下幾個問題：①添加的藥物量必須與實際測定量相近；②添加物質(zhì)必須與實際存在的狀態(tài)相似；③必須同時做空白試驗。,,上述①、 ②兩點的原因：一是如果添加量大，實際測定量小，那么有可能測定量在回收率的誤差范圍內(nèi)，這樣就不可靠；二是如果添加量大，蛋白質(zhì)實際結(jié)合能力小，這樣存在在空白血樣中的添加藥物部分沒有結(jié)合，與實際存在的情況不符，測得回收率容易偏高。因此在報道一個方法的回收率時，必須說明添加量。,,方法

24、的準確度有時也可用一個已證明有相當專屬性和可靠性的方法與新建立的方法同時進行測定，然后比較兩法測得結(jié)果的相關(guān)程度。用相關(guān)系數(shù)r來表示，一般要求r＞0.95，直線的斜率接近1，表明兩法吻合。,(二)精密度,精密度(precision)是表示一組測量值彼此符合的程度。有多種表示方法，在體內(nèi)藥物分析中常用的表示方法有：,,精密度測定通常采用高、中、低三種濃度進行測定。低濃度選擇在定量限(LOQ)附近，高濃度在標準曲線的上限附近，中間選一個濃度

25、。每個濃度平行測定5～7次，計算測定結(jié)果的標準差。除定量限外，各濃度點的RSD不應大于15％，最低定量限這一點不應大于20％。精密度可進一步分為日內(nèi)或批內(nèi)精密度和日間或批間精密度。前者表示一次測定的重復性，后者表示不同時間測定結(jié)果的重復性。,,日內(nèi)(或批內(nèi))精密度是考察分析方法在短期內(nèi)測定方法的變異情況，凡是在同一天內(nèi)將樣品多次測定所計算出的精密度稱為日內(nèi)精密度；凡在同一批內(nèi)樣品多次測定所計算出的精密度稱為批內(nèi)精密度。所謂“批內(nèi)”是指

26、測定時使用同批試劑、同一條標準曲線等主要相同條件下完成的分析測定。,,日間(或批間)精密度是考察分析方法在不同時間測定結(jié)果的變異情況。由于體內(nèi)藥物分析面臨樣品數(shù)量多，測定持續(xù)時間長，往往在同一天或同一批內(nèi)不能完成，因此樣品測定時使用的儀器性能、試劑、標準曲線及環(huán)境條件等都可能發(fā)生微小的變化，從而導致分析結(jié)果的變異增大。因此，考察分析方法的精密度時，還應考察日間或批間精密度。測定時可使用日內(nèi)(或批內(nèi))精密度測定時，所使用的高、中、低三種濃

27、度樣品，在同一周內(nèi)不同日(或不同批)分別測定3～5次，然后計算出RSD。,（三）靈敏度,靈敏度(sensitivity)是指一種方法可以檢測出有關(guān)化合物的最小量，常用以下幾種表示方法。1．檢測限(limit of detection，LOD)檢測限表示在生物介質(zhì)中藥物的最低可測度(或絕對量)。通常以被測信號和背景噪音比S/N為2～3倍時的被測物的絕對量來表示，LOD＝3N/S（N＝噪音，S＝被測物信號/單位重量)。,,例如，在色譜

28、分析中，測得N＝1mm，取2ug/mL的樣品液20uL進樣，測得峰高為30mm。按上式計算：,即以S/N＝3時，測得樣品的LOD為4ng。也可通過多次空白試驗，求得背景響應的標準差，再乘以2或3，作為LOD的估計值，然后配制相應檢測限濃度樣品，反復測試來確定。,2．定量限(limit of qnantification，LOQ),定量限是指生物介質(zhì)中藥物可定量測定的最低量，表示方式和測定方法與檢測限相同，它與檢測限的不同在于定量限規(guī)定

29、的最低測得濃度應該符合一定精密度和準確度的要求。,,通常以標準曲線的最低濃度點作為定量限。也可以S/N＝10或空白背景響應的標準差乘以10作為估計值，再通過試驗確定。在進行藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗時要求LOQ至少能滿足測定3～5個半衰期時樣品中的藥物濃度，或Cmax的1/10～1/20時的藥物濃度。,3．最低檢測濃度,最低檢測濃度則多指可進行定量測定的某一藥物的最低濃度，它與樣品體積大小等因素有關(guān)，可通過下式求得，,,以

30、上表示靈敏度的方法均是指儀器的靈敏度，即進入儀器的最低絕對量或最低濃度。如果我們要知道體內(nèi)樣品的濃度檢測限，則要根據(jù)樣品處理方法，考慮稀釋度。體內(nèi)樣品的濃度檢測限＝儀器的濃度檢測限×樣品稀釋度,,例如，取血樣1mL，經(jīng)處理后進樣前的血樣最終體積為0.1mL，已知最低檢測濃度為10-6，則血樣中被測物的最低濃度為0.1×10-6。若經(jīng)處理后，最終體積為10 mL，則血樣中被測物的最低濃度為10×10-6。

31、這表明雖然儀器靈敏皮相同，但因樣品預處理方法不同，就有可能影響到實際樣品測定的靈敏度。,,要提高檢測靈敏度，可采用如下一些方法：①提高儀器本身的靈敏度；②提高進樣量；③降低儀器噪音；④提高樣品的濃縮程度或降低樣品稀釋度；⑤消除干擾，降低空白值，這可通過改變色譜條件，改進預處理方法來減少于擾雜質(zhì)的影響。,（四）方法的專屬性,方法的專屬性(specificity)也稱選擇性(selectivity)，是指樣品中含有其他共存物質(zhì)時，

32、該法定量測定被測物的能力。即測定的訊號應是屬于被測物所特有的，否則就易受干擾?？疾煲粋€方法是否專屬，應著重考慮代謝物、內(nèi)源性物質(zhì)和同時服用藥物的干擾。,,專屬性的測定通常取6個個體空白樣品(要求對這6個個體的取樣時間、膳食結(jié)構(gòu)以及影響實驗的其他因素加以控制)，采用擬定的方法進行測定。所得結(jié)果與接近于定量限的被測物濃度的純?nèi)軇┤芤核媒Y(jié)果進行比較。在藥物、代謝物、內(nèi)標物的tR處不應有大的干擾，任何有大的干擾的空白應舍去。如果大于10％的

33、空白樣品顯示大的干擾，應另取一組空白樣品重試，如果仍有10％以上的空白樣品顯示大的干擾，則應改變擬定的方法，以消除干擾。,,在報告專屬性時，若采用色譜法測定，至少要提供空白生物樣品色譜圖，空白生物樣品外加標準品色譜圖及用藥后的樣品色譜圖。,(五)線性范圍,線性范圍(1inear range)是指利用該法取得精密度、準確度均符合要求的試驗結(jié)果，而且成線性的供試物濃度的變化范圍。通常是將藥物標準品加入空白體液中，制成一系列不同濃度的標準液

34、，按規(guī)定方法處理、測定。根據(jù)藥物標準品濃度和響應的信號值繪制標準曲線，或計算回歸方程，求出r值和濃度范圍。,,標準曲線的制備一般由一個空白，一個零標準(空白樣品加內(nèi)標)和5～8個非零標準(系列濃度標樣)組成，要求覆蓋實際的樣品濃度范圍，包括LOQ?？瞻缀土銟藴什挥米鳂藴是€的計算，僅作為對干擾的考察。線性程度可用最小二乘法處理數(shù)據(jù)，求得相關(guān)系數(shù)r，一般r不應低于0.99，同時必須符合一定的精密度和準確度。要求LOQ處偏離標準濃度應小等

35、于20％，其他各點應小等于15％。,（六）穩(wěn)定性,藥物的穩(wěn)定性(stability)是貯存條件、藥物的化學性質(zhì)、空白生物樣品和容器系統(tǒng)的函數(shù)。在特定的容器和生物樣品中待測物的穩(wěn)定性不能外推至其他系統(tǒng)。在生物樣品中待測物的穩(wěn)定性包括長期貯存、短期貯存和冷凍-解凍循環(huán)過程中的穩(wěn)定性，也包括標準貯備液中待測物的穩(wěn)定性。,1．長期貯存穩(wěn)定性,長期穩(wěn)定性的貯存時間應超過收集第一個樣品至最后一個樣品分析所需的時間周期。貯存溫度一船為-20℃，如果

36、需要也可在-70℃貯存。要求高、低濃度至少分別測定3次，與第一天測得的相應濃度的結(jié)果進行比較。,2．短期室溫穩(wěn)定性,高、低濃度各3份于室溫下放置4～24h(根據(jù)實際操作在室溫中需維持的時間而定)，在不同時間點取樣，進行分析，與0h測得結(jié)果進行比較。,3．冷凍-解凍穩(wěn)定性,取高、低濃度樣品至少各3份，于-20℃貯存24h，取出置室溫放置使自然融解。當融解完全后，取樣，進行分析。然后再把樣品放回冷凍狀態(tài)保持12～24h，如此解凍-冷凍應重復

37、循環(huán)二次以上，然后比較各次分析結(jié)果。,4．貯備液穩(wěn)定性,藥物與內(nèi)標的貯備溶液的穩(wěn)定性應對其在室溫下至少6h的穩(wěn)定性進行考察，然后將其冷藏或冷凍7～14d或恰當周期后進行測定，所得儀器響應值與新鮮配制溶液所得響應值進行比較。,應用實例,例1：用HPLC法測定生物樣品中淫羊藿苷的濃度。1、實驗方法(1)色譜條件 色譜柱：Zorbax ODS(10um，4.6mm×250 mm)；柱溫：35℃；流動相：四氫呋喃-水-冰醋酸(2

38、0：75：5)；流速：1.0 mL/min；紫外檢測波長：270nm；檢測靈敏度：0.02UFS。,(2)生物樣品的處理,①血漿：取樣品0.1mL置10 mL離心管中，加入乙酸乙酯3.5mL，振蕩3min，離心(2000 r/min，5min)，移取上清液，于50℃水浴用氮氣吹干，殘渣加內(nèi)標液100uL，振蕩溶解后進樣20uL。,,②糞和尿：大鼠糞便樣品于室溫風干稱重后，置乳缽內(nèi)研成細末，用生理鹽水按10％稀釋使其成混懸液。取混懸液0.

39、5mL或尿樣0.5mL用乙酸乙酯4.0mL提取兩次，合并兩次提取液，于50℃水浴用氮氣吹干，加入甲醇1.0 mL，振蕩溶解后進樣10 uL。,,③組織勻漿：將大鼠斷頭處死，取心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、腦、睪丸各組織，稱重，用組織勻漿器制成生理鹽水勻漿，使每mL含各組織0.4g，取此勻漿0.2mL，按血漿樣品處理方法進行處理分析。,2．結(jié)果與討論,(1)色譜行為 在上述色譜條件下，淫羊藿苷(icariin，ICA)與內(nèi)標、淫羊藿提取

40、液中的其他6種成分及血漿內(nèi)源性物質(zhì)得到良好分離(見圖4-1)，ICA及內(nèi)標苯甲酸的保留時間分別為7.92min和11.93min。,,,,(2)標準曲線的制備用甲醇精密配制成1mg/mL ICA標準貯備液，再用甲醇稀釋成100ug/mL標準工作液，置冰箱保存。另用甲醇制成1mg/mL內(nèi)標貯備液，再用甲醇稀釋成40ug/mL標準工作液，置冰箱保存。用ICA標準工作液及空白生物樣品配制標準系列，按樣品預處理方法操作，以ICA與IS峰高比為

41、縱坐標，ICA濃度為橫坐標繪制標準曲線，計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。,,由于糞和尿中的代謝產(chǎn)物干擾內(nèi)標色譜峰，因此糞和尿采用外標法、以ICA峰高為縱坐標，ICA濃度為橫坐標繪制標準曲線。結(jié)果血漿、尿、組織勻漿和糞的線性范圍分別為：1～128，2～32，2～32，4～64ug/mL。血漿的標準曲線方程(n＝6)為：,其他生物樣品標準曲線方程的r值均大于0.99。,,(3)回收率 分別于空白血漿中準確加入一定量的ICA標準工作液，按上述方法經(jīng)

42、提取后進行HPLC分析，按血漿標準曲線方程測得濃度，求出方法回收率。標準品經(jīng)提取后，與標準品直接進樣測定所得各對應標準品與內(nèi)標峰高比值相比較，求得血漿樣品的提取回收率，見表4-1。其他生物樣品的方法回收率均大于95.26％，提取回收率均大于73.57％。,,,,(4)精密度 用空白血漿制成含ICA 2，8，32，128 ug/mL樣品溶液各5管，測定日內(nèi)及日間誤差，結(jié)果見表4-1。其他生物樣品的日內(nèi)、日間相對標準偏差(RSD)均小于

43、7.1％。(5)靈敏度測定 按色譜峰信噪比(S/N)為3作為檢測下限，結(jié)果顯示ICA的最低檢測濃度為0.5ug/mL。,,(6)色譜分析條件選擇 淫羊藿提取液中的主要化學成分為淫羊藿苷，還有其他黃酮類化合物存在，因此在上述色譜條件下可出現(xiàn)6～7個蜂。為了獲得最佳分離效果，首先用甲醇:水為流動相進行分離，當比例為55:45時，雖然ICA與其他化學成分已分離，但其保留時間較長，峰形較寬，且柱壓較高。為此，選用對黃酮類化合物分離選擇性較

44、好的四氫呋喃，并加入一定量的冰醋酸，使弱酸化合物分離效果更佳。經(jīng)過調(diào)整不同比例，多次試驗，最后確定四氫呋喃:水:冰醋酸最佳配比為20:75:5。,,(7)內(nèi)標選擇 為能用內(nèi)標法準確測定ICA濃度，本文對槲皮素、蘆丁、橙皮苷、氨茶堿、阿斯匹林、非那西汀、黃體酮、苯甲酸和蘭萼甲素等13種藥物進行了測定，考察其與ICA在血漿中的分離情況，結(jié)果用保留時間小于ICA的藥物作內(nèi)標時，往往被血漿中干擾峰所干擾。阿斯匹林、非那西汀均在ICA前1～5m

45、in出峰，卻被淫羊藿提取液中其他成分所干擾。蘭萼甲素和苯甲酸均在ICA后2～4min出峰，沒有任何峰干擾，因此兩者均可作為內(nèi)標，考慮到苯甲酸方便易得，故選用苯甲酸作為內(nèi)標。,,(8)提取溶媒的選擇 本文考察了用乙醇、乙酸乙酯及乙醇:乙酸乙酯(1:5)為溶媒對ICA進行提取測定，發(fā)現(xiàn)前者提取回收率小于60％，而后者雖然提取回收率大于95％，但帶入雜質(zhì)峰較多，而且色譜系統(tǒng)穩(wěn)定性下降。因此實驗選用乙酸乙酯為提取溶媒，各生物樣品的提取回收率均

46、大于73％，且方法穩(wěn)定。,,(9)藥物在生物樣品中的穩(wěn)定性 于各空白樣品中加入ICA標準品，配制成15ug/mL濃度的樣品數(shù)份，置-20℃冰箱保存，分別于第0、5、15、30 d按實驗方法測定，RSD均小于7.1％。說明該藥物在各生物樣品中-20℃冰箱保存下，至少可穩(wěn)定1個月。,,(10)血藥濃度的測定 為了檢驗上述方法是否能滿足ICA的藥代動力學研究，應用本方法進行了大鼠靜脈注射淫羊藿提取液。由大鼠頸靜脈按10mg/kg靜脈注射，

47、于給藥后5，10，15，20，25，30，40，60，80，120，180 min于頸靜脈各取血0.25mL，肝素抗凝，離心后取血漿0.1mL，按上述方法提取和測定ICA濃度，以給藥時間為橫坐標，血漿中ICA的對數(shù)濃度為縱坐標繪制藥時曲線，見圖4-2。,,血藥濃度測定結(jié)果表明，本文建立的分析方法可滿足ICA藥代動力學研究的需要，具有靈敏度高、準確性好等優(yōu)點。,,例2：用RP-HPLC法同時測定依普黃酮及其代謝物M-I血漿濃度。1．實驗

48、方法(1)色譜條件 檢測波長：254nm；色譜柱：Waters Nova-Pak C18柱(5um，3.9mm×150 mm)；流動相：磷酸鹽緩沖液(0.02mol/L，pH值3.5)-乙腈(1:1)；流速：1.0mL/min；靈敏度：0.001AUFS；柱溫：室溫；進樣量：10～20 uL。,,(2)溶液配制①標準液及內(nèi)標液：精密稱取依普黃酮對照品10.00 mg于10mL量瓶中，加入乙腈溶解并稀釋至刻度，精密量取此液

49、1.00 mL以流動相稀釋至50.0mL，使其成20mg/L標準儲備液，4 ℃避光保存。精密稱取依普黃酮代謝物M-I對照品10 mg，同法制成25mg/L標準儲備液，4 ℃避光保存。另以流動相為溶劑配制30mg/L的克霉唑溶液作為內(nèi)標液，同法冷藏備用。,,②流動相：0.02mol/L磷酸二氫鉀溶液，以磷酸調(diào)pH值至3.5，過濾，與等量乙腈混合，超聲脫氣10min。,,(3)標準曲線的繪制①標準血漿：精密量取依普黃酮標準貯備液和代謝物M

50、-I標準貯備液各100uL于10mL刻度試管中，加入空白血漿9.80mL，振蕩混勻，再進行倍比稀釋，使其成每mL含依普黃酮200.0，100.0，50.0，25.0，12.5，6.25，3.125ng，含代謝物M-I 250.0，125.0，62.5，31.25，15.625，7.813，3.906ug/L的標準血漿。,,②標準曲線：精密量取上述標準血漿1.00mL于10mL具塞玻璃試管中，加人提取緩沖液800 uL和內(nèi)標液100uL，

51、搖勻后加提取液叔丁基甲醚3mL，于液體混合器內(nèi)混合液渦旋處提取1min，離心(3000r/min)10min，吸取上層有機相置5mL尖底刻度試管中，在40℃水浴中通氮氣吹干，以100uL流動相富集，進樣10～20 uL，測定峰高，依普黃酮與內(nèi)標的峰高之比為橫坐標，依普黃酮濃度為縱坐標繪制標準曲線；同法繪制代謝物M-I標準曲線。,,2．結(jié)果與討論(1)線性范圍和靈敏度 血漿中依普黃酮濃度在4～200.0ug/L范圍內(nèi)，代謝物M-I濃度

52、在4～250.0ug/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，標準曲線方程分別為：,在本文條件下血漿中依普黃酮及代謝物M-I最低檢測濃度分別為2.0ug/L和2.5ug/L，最低檢測量分別為0.04ng和0.05ng。,,(2)回收率與精密度實驗①提取回收率：取上述標準血漿，按標準曲線項下方法處理，進樣，測得峰高。另配制相應濃度的依普黃酮及其代謝物M-I溶液，在相同條件下直接進樣，測定峰高，連續(xù)測定5次。平均提取回收率見表4-2。,,,,②方法回收率

53、：取上述標準血漿，按標準曲線項下方法處理、測定，按標準曲線方程計算回收率，連續(xù)測定5次，結(jié)果見表4-3。,,③精密度：取上述標準血漿，按標準曲線項下方法處理、進樣，連續(xù)測定5次，計算日內(nèi)誤差；另取上述不同濃度的標準血漿各5份，同法處理、進樣，計算日間誤差。,,(3)選擇性 選用檢測波長λ＝254nm，在本文色譜條件下，依普黃酮及其代謝物M-I、內(nèi)標物均有較大吸收。標準血漿中依普黃酮及其代謝物M-I和內(nèi)標的保留時間分別為9.59．3.2