藥殘檢測(cè)原理

1、藥物殘留檢測(cè)的基本原理,王玉峰2013.04,藥物殘留 主要包括農(nóng)藥殘留和獸藥殘留、真菌毒素。,農(nóng)藥殘留 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中施用農(nóng)藥后一部分農(nóng)藥直接或間接殘存于谷物、蔬菜、果品 、畜產(chǎn)品、水產(chǎn)品以及土壤和水體中的現(xiàn)象。如滴滴涕，毒死蜱，馬拉硫磷等。,獸藥殘留 是指用藥后蓄積或存留于畜禽機(jī)體或產(chǎn)品(如雞蛋、奶品、肉品等)中原型藥物或其代謝產(chǎn)物。如氯霉素，克倫特羅，硝基呋喃等。,真菌毒素,黃曲霉素：B1、M1、B2、M2

2、、G1、G2桔霉素：展青霉素：玉米赤霉類：玉米赤霉烯酮、玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉烷酮,其它,孔雀石綠、隱性孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱性結(jié)晶紫糖皮質(zhì)激素：潑尼松龍、甲基潑尼松龍、潑尼松、氫化可的松、可的松、倍他米松、地塞米松、倍氯米松、醋酸氟氫可的松雌激素類：己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚,獸藥殘留檢測(cè)方法,酶聯(lián)免疫法：各種試劑盒液質(zhì)質(zhì)聯(lián)用儀：LC-MS/MS，三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀、雜合三重四級(jí)桿(QTRAP)試紙條：微流

3、控芯片：微生物抑制法：高效液相色譜,第一部分 酶聯(lián)免疫技術(shù)在藥殘檢測(cè)和 病毒抗體檢測(cè)中的應(yīng)用,酶聯(lián)免疫檢測(cè)的原理,①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。③在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)

4、分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。④加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺定性或定量分析。,優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高(ppb) ②操作步驟易掌握；不足：①有些試劑盒價(jià)格昂貴 ②易出現(xiàn)假陽(yáng)性，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)反復(fù),酶聯(lián)免疫檢測(cè)獸藥殘留的方法類型,三種必要的試劑： ①固相的抗原或抗體，②酶標(biāo)記的抗原或抗體，③酶作用的底物。,實(shí)例1.瘦肉精

5、，磺胺類藥殘-間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法(北京勤邦) 在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，標(biāo)品或樣本中殘留的克倫特羅和預(yù)包被抗原競(jìng)爭(zhēng)抗克倫特羅的抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與殘留物克倫特羅負(fù)相關(guān)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出克倫特羅殘留量。,瘦肉精-間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法,3,3’，5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB),TMB 氧化產(chǎn)物,加硫酸終止液后,ELISA顯色機(jī)理,實(shí)例2.氯霉素-直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法(杭州迪恩)

6、 標(biāo)品或樣品中的游離氯霉素與酶標(biāo)記的氯霉素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶標(biāo)板微孔中固相化的抗氯霉素抗體，通過(guò)清洗洗掉未結(jié)合的酶標(biāo)記氯霉素，通過(guò)添加底物顯色。樣品的吸光值與濃度成負(fù)相關(guān)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出氯霉素的殘留量。磺胺七合一直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法(天津九鼎),酶聯(lián)免疫檢測(cè)獸藥殘留的方法類型,氯霉素-直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法,酶聯(lián)免疫檢測(cè)獸藥殘留的方法類型,實(shí)例3.硝基呋喃-間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法(無(wú)錫同昕) ELISA原理類

7、似于瘦肉精的檢測(cè)，不同之處是硝基呋喃需要衍生。 硝基呋喃類藥物在體內(nèi)很快就能被代謝，代謝物在組織中則能存留較長(zhǎng)的一段時(shí)間，所以我們檢測(cè)的實(shí)為硝基呋喃的代謝物。由于代謝物均為較小分子，屬于半抗原，因此制備其抗體時(shí)，需要進(jìn)行衍生后，免疫動(dòng)物獲得抗體(也有可能是單克隆抗體)。 此處的衍生試劑還沒(méi)有確定是否和GB中的衍生化試劑類似？,硝基呋喃-間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法,實(shí)例4.偽狂犬病病毒(PRV)直接競(jìng)爭(zhēng)ELI

8、SA法 在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被PRV的抗原PRV gB，陽(yáng)性對(duì)照或樣本中的抗體在第一次孵育時(shí)和包被抗原特異性結(jié)合；清洗微孔后加入酶標(biāo)記的抗PRV gB的單克隆抗體，第二次孵育時(shí)酶標(biāo)單抗和樣本中的抗體競(jìng)爭(zhēng)吸附微孔條中的抗原。再次清洗微孔后加入底物TMB顯色，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與抗體濃度負(fù)相關(guān)。即免疫成功，產(chǎn)生了抗體，顯色的OD630值小于陰性對(duì)照?？沟湫托载i流感病毒血清，抗口蹄疫病毒血清的檢測(cè)

9、均采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法。,酶聯(lián)免疫檢測(cè)病毒抗體的方法類型,(PRV)疫苗直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法,實(shí)例5.豬繁殖與呼吸道綜合癥(藍(lán)耳病，PRRS/US)的間接ELISA法 在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被PRRS/US的抗原，陽(yáng)性對(duì)照或樣本中的抗體在第一次孵育時(shí)和包被抗原特異性結(jié)合；清洗微孔后加入酶標(biāo)記的抗豬的二抗，第二次孵育時(shí)酶標(biāo)二抗和抗原抗體復(fù)合物結(jié)合。再次清洗微孔后加入底物TMB顯色，樣本吸光值與抗體濃度正相關(guān)。即免疫成

10、功，產(chǎn)生了抗體，顯色的OD450值大于陰性對(duì)照。,酶聯(lián)免疫檢測(cè)病毒抗體的方法類型,PRRS/US疫苗的間接ELISA法,第二部分：液質(zhì)質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在藥殘檢測(cè)中的應(yīng)用,液質(zhì)質(zhì)聯(lián)用技術(shù),藥物在體內(nèi)經(jīng)過(guò)肝腎等器官的代謝被轉(zhuǎn)化后，經(jīng)尿液和糞便排出體外，只有極少部分殘留在肌肉組織，在肝臟和腎臟中的濃度較高，但總體濃度均在ppb級(jí)(μg/kg=ng/mL)。痕量檢測(cè)最常用的方式是酶聯(lián)免疫試劑盒和液相-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。,液質(zhì)質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，顧名思義將液

11、相色譜的高效分離和質(zhì)譜的高靈敏度有機(jī)結(jié)合，串聯(lián)質(zhì)譜更提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。液質(zhì)質(zhì)聯(lián)用是藥殘檢測(cè)最常用的檢測(cè)方法之一，在國(guó)標(biāo)，歐盟和美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)中被廣泛采納。,液質(zhì)質(zhì)聯(lián)用儀簡(jiǎn)圖,三重四級(jí)桿(Q1Q2Q3)工作原理,MS1(母離子選擇),MS2(子離子選擇),質(zhì)量分析器工作原理,獸藥殘留,氯霉素類：氯霉素(0.1ppb)、甲砜霉素和氟苯尼考(1ppb)硝基呋喃：呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮(0.5ppb)紅霉素類：紅霉素、替

12、米考星、泰樂(lè)菌素、林可霉素、螺旋霉素、交沙霉素、 吉他霉素、克林霉素和竹桃霉素(1ppb)四環(huán)素類：土霉素、金霉素、四環(huán)素和強(qiáng)力霉素(5ppb)β-受體激動(dòng)劑：沙丁胺醇、特布他林、塞曼特羅、塞布特羅、萊克多巴胺、克倫特羅、溴布特羅、苯氧丙酚胺、馬布特羅、馬賁特羅、溴代克倫特羅鎮(zhèn)定劑：乙酰丙嗪、氯丙嗪、異丙嗪、丙酰丙嗪、甲苯噻嗪、地西泮喹諾酮類：伊諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、丹諾沙星