酶工程（一）

1、酶 工 程（一）,酶工程,概述酶的化學(xué)本質(zhì)、來源和生產(chǎn)酶催化反應(yīng)機理及反應(yīng)動力學(xué)酶的固定化和固定化酶反應(yīng)器酶工程的應(yīng)用酶工程的研究進展,一 酶和酶工程的概述,（一）、 酶的概念（二）、 對酶的認識和研究歷程（三）、 酶工程的概念,（一）、 酶的概念,酶是生物催化劑，主要是蛋白質(zhì)，也有核酸，能在比較溫和的條件下高效率的起催化作用，使生物體內(nèi)的各種物質(zhì)處于不斷的新陳代謝中。 生物體內(nèi)→新陳代謝→各種化學(xué)反應(yīng)→條件溫

2、和（37℃，近中性），速度快，有條不紊。,（二）、 對酶的認識和研究歷程,人們對酶的認識起源于生產(chǎn)實踐，人類幾千年前，都開始制作發(fā)酵及食品。1833 年，Pagon Persoz 從麥芽中得到一種能水解淀粉的物質(zhì)——淀粉酶。1878 年，Kühne 將這類生物催化劑統(tǒng)稱為“酶”（Enzyme）1887年，Buechner兄弟發(fā)現(xiàn)不含酵母細胞的酵母提取液也能使糖生成酒精，證實了發(fā)酵與細胞活力無關(guān)，并表明了酶能以溶解的、有活

3、性的狀態(tài)從破碎的細胞中分離出來。1926 年，Sumner 從刀豆中提取脲酶，得到結(jié)晶，證明是蛋白質(zhì)。后來，先后獲得胃蛋白酶，胰蛋白酶的結(jié)晶1969 年人工合成牛胰核糖核酸酶。1983 年，發(fā)現(xiàn)核酸的催化功能——1989 獲諾貝爾獎,（三）、 酶工程的概念,酶工程：工業(yè)上有目的地設(shè)計一定的反應(yīng)器和反應(yīng)條件，利用酶的催化功能，在常溫常壓下催化化學(xué)反應(yīng)，生產(chǎn)人類需要的產(chǎn)品或服務(wù)于其它目的的一門應(yīng)用技術(shù)。廣義地講還包括酶的生產(chǎn)、分離和

4、純化。國際酶工程學(xué)會（1971年）定義：是研究和開發(fā)酶的生產(chǎn)、酶的分離純化、酶的固定化、酶及固定化酶的反應(yīng)器、酶與固定化酶的應(yīng)用等的工程科學(xué)。,,按現(xiàn)代觀點，酶工程主要包括以下內(nèi)容酶的大量生產(chǎn)和分離純化及它們在細胞外的應(yīng)用新穎酶的發(fā)現(xiàn)、研究和應(yīng)用酶的固定化技術(shù)和固定化酶反應(yīng)器基因工程技術(shù)應(yīng)用于酶制劑的生產(chǎn)與遺傳修飾酶的研究酶分子改造與化學(xué)修飾以及酶結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的研究有機介質(zhì)中酶的反應(yīng)酶的抑制劑、激活劑的開發(fā)及應(yīng)用研

5、究抗體酶、核酸酶的研究模擬酶、合成酶以及酶分子的人工設(shè)計、合成的研究,二、酶化學(xué)本質(zhì)、來源和生產(chǎn),（一）酶的化學(xué)本質(zhì)（二）酶的來源和生產(chǎn),（一）酶的化學(xué)本質(zhì),除了核酸酶之外，酶都是具有催化功能的蛋白質(zhì)。1 蛋白質(zhì)的性質(zhì),2、酶的化學(xué)組成,1 按組成成分（1）單純酶：其活性僅僅取決于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，如脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及核糖核酸酶。（2）結(jié)合酶：只有結(jié)合非蛋白組分后（輔助因子）后才表現(xiàn)出活性 全酶=酶蛋白＋輔

6、助因子2、按酶分子大?。?）單體酶：一般有有1條多肽鏈組成，幾乎都是水解E，Mr=13000～35000，不含四級結(jié)構(gòu)，如溶解酶，胰蛋白酶等（2）寡聚酶：由幾個亞基通過非共價鍵結(jié)合，Mr=35000～數(shù)百萬，具有四級結(jié)構(gòu)，如磷酸化酶a和3-磷酸甘油醛脫氫酶（3）多酶復(fù)合體：由幾種酶嵌合而成的復(fù)合體，靠共價鍵連接 Mr﹥幾百萬。 （4）核酶 少數(shù)RNA 具有自我拼接加工的催化活性。,（二）酶的來源和生產(chǎn),1 酶的來源1）

7、直接從動植物獲得，即從生物體中分離和提純不足：生產(chǎn)周期長，來源有限，還要受一些自然條件的限制。2）化學(xué)合成方法不足：一般只適用于短肽的生產(chǎn),3） 工業(yè)微生物發(fā)酵，即通過液體深層發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵，是工業(yè)上酶的主要來源。其優(yōu)點如下：微生物種類繁多，制備出的酶種類齊全微生物繁殖快，生產(chǎn)周期長微生物具有較強的適應(yīng)性和應(yīng)變能力，可以通過適應(yīng)、誘導(dǎo)、誘變以及基因工程等方法培育出新的高產(chǎn)酶的菌株。,微生物細胞產(chǎn)生的酶分類結(jié)構(gòu)酶：在細胞的

8、生長過程中出于其自身需要而表達，誘導(dǎo)酶：加入相應(yīng)的誘導(dǎo)劑后才會表達，誘導(dǎo)劑一般是該酶所催化反應(yīng)的底物或產(chǎn)物。一般而言，野生型微生物需要經(jīng)過遺傳改造后，才能變?yōu)楦弋a(chǎn)酶的菌株。其方法包括物理誘變育種化學(xué)誘變育種基因工程構(gòu)建,優(yōu)良菌種的條件繁殖快、產(chǎn)酶量高、酶的性質(zhì)符合使用要求，而且最好能產(chǎn)生分泌到胞外的酶，產(chǎn)生的酶容易分離純化菌種不易變異退化，產(chǎn)酶性能穩(wěn)定，不易受噬菌體的感染侵襲易于培養(yǎng)，能夠利用廉價的原料進行酶的生產(chǎn)，并且

9、發(fā)酵周期短。菌種不是致病菌，在系統(tǒng)發(fā)育上與病原體無關(guān)，不產(chǎn)生有毒物質(zhì)和其他生理活性物質(zhì)不產(chǎn)或盡量少產(chǎn)蛋白酶,一些常用微生物及它們所產(chǎn)生的酶,2. 酶的生產(chǎn),影響酶生產(chǎn)的主要因素1）培養(yǎng)基設(shè)計：設(shè)計好供微生物生長、繁殖、代謝和合成代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)物質(zhì)和原料。其中誘導(dǎo)酶的生產(chǎn)，需要加入誘導(dǎo)劑2）發(fā)酵方式的選擇：固體發(fā)酵：又稱為表面培養(yǎng)或曲式培養(yǎng)，以麩皮、米糠等為基本原料，加入適量的無機鹽和水作為培養(yǎng)基進行產(chǎn)酶微生物菌種培養(yǎng)的一種培養(yǎng)

10、技術(shù)。 特點：設(shè)備簡單、便于推廣，特別適合于霉菌， 缺點: 發(fā)酵條件不易控制，物料利用不完全，勞動強度大，容易染菌等。液體深層發(fā)酵：又稱浸沒式培養(yǎng)，利用液體培養(yǎng)基，在發(fā)酵罐內(nèi)進行的一種攪拌式通氣培養(yǎng)方式，發(fā)酵過程需要一定的設(shè)備和技術(shù)條件，動力消耗也較大，但是原料的利用率和酶的產(chǎn)量都較高。目前，工業(yè)上主要采用液體深層發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)酶，但是在酒曲培養(yǎng)、食品工業(yè)及一些用于飼料添加劑的酶生產(chǎn)中，仍在應(yīng)用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)。,

11、3）發(fā)酵條件控制營養(yǎng)條件環(huán)境條件，注意溶氧濃度、溫度、pH值特別注意剪氣力對蛋白質(zhì)的影響，因為在高剪切力下，蛋白質(zhì)容易失活。注意發(fā)酵的泡沫，因為蛋白質(zhì)是表面活性劑，大量的蛋白質(zhì)積累在發(fā)酵液中使得在鼓泡條件下很容易形成泡沫，影響發(fā)酵正常操作。因此應(yīng)該考慮除泡裝置，并添加消泡劑。,3. 酶的分離和提純,1）酶的用途及對酶純度的要求：科學(xué)研究——需要最高的純度，必要時需要結(jié)晶醫(yī)用——需要很高的純度，避免不良反應(yīng)食品工業(yè)——在安全

12、性的基礎(chǔ)上，純度可低一些工業(yè)用——在達到一定酶活性的基礎(chǔ)上，對純度要求不高,2）酶的分離提純在酶生產(chǎn)中投入成本很大蛋白酶的濃度很低，而分離提純的費用往往隨著產(chǎn)物初始濃度的下降呈指數(shù)式上升。細胞破碎液或發(fā)酵液存在大量與目標(biāo)酶蛋白性質(zhì)類似、分子量接近。酶對環(huán)境條件敏感，環(huán)境中的蛋白酶容易作用于目標(biāo)酶，使其失活。,3）在實現(xiàn)目的的情況，可直接用整個細胞作為生物催化劑細胞內(nèi)目標(biāo)酶的活性很高，可以滿足工業(yè)過程對酶活的要求胞內(nèi)酶的催化作

13、用必須依賴于輔酶，可以利用細胞內(nèi)的輔酶再生系統(tǒng)所需要的生物轉(zhuǎn)化過程需要細胞內(nèi)幾種酶的共同參與,,4）酶的分離提純的步驟在此過程中，保持酶的活性是最為關(guān)鍵的。因此，全部操作必須在低溫下進行，一般在0～5℃間，還要防止重金屬失活、防止－SH被氧化，不能過度攪拌等,細胞破碎的方法：動物細胞比較容易破碎，通過一般的研磨器、勻漿器、搗碎機等可達到目的細菌細胞壁較厚，破碎需要用超聲波、細菌磨、溶菌酶、某些化學(xué)溶劑（如甲苯、去氧膽酸納）或凍融

14、等處理破碎后的分離方法：過濾、沉降等,酶的分離純化鹽析法：eg（NH4）SO4、Nacl，Na2SO4、使E↓析出之后需超鹽處有機溶劑沉淀法：用30～60%的乙醇、丙酮、異丙醇等，保持低溫-10～-15℃等電沉淀法：調(diào)節(jié)到PI使之絮聚、沉降。層析法：親和層析，離子交換層析，凝膠過濾曾析，吸附層析等酶的保存：低溫、干燥、避光、避氧。,四、酶催化反應(yīng)機理及反應(yīng)動力學(xué),（一）酶催化反應(yīng)的特點（二）酶催化反應(yīng)的機理（三）酶催化反

15、應(yīng)的速率理論（四）酶促反應(yīng)動力學(xué),（一）酶催化反應(yīng)的特點,反應(yīng)條件溫和：常溫、常壓、接近中性的pH值催化效率高。以分子比表示，酶催化比非催化的反應(yīng)速度高108－1020倍，比其他催化反應(yīng)高107－1013。 舉例1：H2O2→H2O＋O2 （?。〧e2+催化 10-5mol/s （ⅱ）H2O2E催化105mol/sE的催化能力高1010倍 舉例2：已知催化反應(yīng)最快的是碳酸酐酶。 CO2＋H2O

16、→ H2CO3 每個E分子每秒可催化6×105個CO2分子與水堿H2CO3比非酶催化快107倍。,酶的作用專一性。通常把酶作用的物質(zhì)稱為該酶的底物（substrate)。一種酶只作用于一種或一類底物。反應(yīng)專一性（鍵專一性）：這些酶的專一性較低，能夠催化具有相同化學(xué)鍵或基團的底物進行某種類型的反應(yīng)。如酯酶底物專一性：只能催化特定底物發(fā)生特定的反應(yīng)。如脲酶只能催化尿素，而且只能是水解反應(yīng)立體化學(xué)專一性：

17、表現(xiàn)為對底物的構(gòu)象有特殊的要求。如L－乳酸脫氫酶只能催化L-乳酸的氧化，而對D-乳酸則不起作用。,酶的催化活力與輔酶、輔基及金屬離子有關(guān)。輔助因子分為輔酶和輔基輔酶：與酶蛋白松弛結(jié)合，可以通過透析或其他方法將其從全酶中除去，如NADH，ATP及各種維生素輔基：以共價鍵和酶蛋白質(zhì)結(jié)合，不易透析除去，如Ca2+、Co2+、Zn2+、Mg2+等金屬離子,,酶易失活。凡使蛋白質(zhì)變性的因素都能使酶破壞而完全失去活性酶活力的調(diào)節(jié)控制。在各種

18、水平上進行，酶水平的調(diào)控方式包括：抑制調(diào)節(jié)、共價修飾調(diào)節(jié)、反饋調(diào)節(jié)、酶原激活及激素調(diào)控等。,,,蛋白質(zhì),1 蛋白質(zhì)的化學(xué)組成 C--------50% H-------- 7% O--------23% N--------16% S--------0～3％ other--- 微量2 分類 簡單蛋白質(zhì)：完全由氨基酸構(gòu)成

19、 如：核糖核酸酶，胰島素 結(jié)合蛋白質(zhì)：另外含有輔基或配基 如：血紅蛋白 核蛋白,,3 蛋白質(zhì)分子量 ——大約6000～1000000之間 ——對于不含輔基的蛋白質(zhì) 氨基酸殘基＝分子量/110,4 氨基酸——蛋白質(zhì)基本結(jié)構(gòu)單位——結(jié)構(gòu)通式， L型，α-碳原子（除脯氨酸）,5 蛋白質(zhì)

20、的構(gòu)象一級結(jié)構(gòu)：多肽鏈共價主鏈的氨基酸順序二級結(jié)構(gòu)：多肽鏈借助氫鍵排列成沿一維方 向具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象三級結(jié)構(gòu)：有規(guī)則構(gòu)象加上無規(guī)則松散肽段四級結(jié)構(gòu)：寡聚蛋白質(zhì)中各個亞基之間在空間上的相互關(guān)系或結(jié)合方式,,6 蛋白質(zhì)的性質(zhì)兩性解離等電點變性：蛋白質(zhì)受到外界各種因素的影響，使其二級、三級結(jié)構(gòu)遭到破壞，天然蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)就會改變，并失去原來的生理功能與活性。