酶工程實驗生物工程09ppt

1、酵母中含有豐富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26),細胞膜內(nèi)側細胞質(zhì)，含有少量的糖。,,,,,,,,,,,外蔗糖酶,內(nèi)蔗糖酶,細胞膜的外側，占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。,由于內(nèi)酶含量很少，極難提取，本實驗提取純化的主要是外酶。,實驗一 酵母蔗糖酶的提取與純化,本實驗以酵母為原料，通過破碎細胞、加熱除雜蛋白、乙醇沉淀、離子交換柱層析等步驟，分離純化酵母蔗糖酶，并用聚丙稀酰胺凝膠電泳對其純度進行初步檢驗。,,有機溶劑分

2、級的原理：有機溶劑分級是利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機溶劑中溶解度的差異分離酶蛋白的一種方法。 其原理是：1、有機溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，使蛋白質(zhì)溶解度下降； 2、有機溶劑與水作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，使蛋白質(zhì)的溶解度下降。,結合力的大小取決于彼此之間相反電荷基團的靜電引力,靜電引力大小與溶液的pH值有關，因pH值決定蛋白質(zhì)的解離程度。,陽離子交換劑 樣品溶

3、液pH＜pI時，酶帶正電荷；陰離子交換劑 樣品溶液pH＞pI時，酶帶負電荷一般樣品溶液的pH與酶pI相差一個pH以上,樣品溶液的pH與酶pI相差越大的，帶電荷越多,通過逐漸增加洗脫液離子強度的梯度洗脫方式，可使結合在層析柱上的蛋白質(zhì)按照結合力由小到大的順序依次被洗出層析柱。,,,,Sampleapplicationand wash,Elution,Equilibration,Regeneration,-,,-,-,

4、,,,,-,,-,,,-,,-,-,-,-,,-,-,-,-,本實驗中使用的DEAE-52是弱堿性的陰離子纖維素，其基本骨架是纖維素、活性基團為二乙基氨乙基（DEAE）。該纖維素的吸附量大，分辨率高，化學性質(zhì)穩(wěn)定。,控制：樣品溶液pH＞pI時，酶帶負電荷,離子交換柱層析的原理：根據(jù)物質(zhì)的酸堿度、極性和分子大小的差異，使其分離的技術在分離過程中，以離子交換劑作用為主導。在眾多的交換劑中，離子交換纖維素的優(yōu)點是：1、開放性的長鏈結構、較

5、大的表面積，所以對蛋白質(zhì)吸附容量大； 2、纖維素上離子基團數(shù)量不多且排列疏散，對蛋白質(zhì)的吸附不是太牢固，所以用緩和的洗脫條件即可達到分離目的，不致引起蛋白質(zhì)變3、用其裝好的層析柱在較廣的pH和鹽濃度范圍內(nèi)都不會發(fā)生體積的改變，所以有利于蛋白質(zhì)層析。本實驗中使用的DEAE-52是弱堿性的陰離子纖維素，其基本骨架是纖維素、活性基團為二乙基氨乙基（DEAE）。該纖維素的吸附量大，分辨率高，化學性質(zhì)穩(wěn)定。,為了確定哪個峰是含目

6、標酶，要進行酶活力的測定； 用蔗糖做底物反應一段時間后，檢測生成的葡萄糖的量；用尿糖試紙初步檢測；用DNS法精確檢測。,Sucrase（蔗糖酶）,glucose＋fructose,Sucrose,Semi-quantitative assay of yeast sucrase activity with U-Glu test-tapeSucrose

7、 glucose oxidase（葡萄糖氧化酶 ） gluconic acid＋H2O2 （葡萄糖酸 ） H2O+O2-

8、 coloured substance,Sucrase（蔗糖酶）,glucose＋fructose,Hydrogen peroxidase（過氧化氫酶）,colourless substance（無色物質(zhì)）,,,U-Glu test-tape尿糖試紙,DNS法精確檢測,黃色的3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑與還原糖在堿性條件下共熱后，自身被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍

9、內(nèi)，反應液里棕紅色的深淺與還原糖的含量成正比而葡萄糖生成量又與待測液的酶活力大小成正比。,酶活定義： 在37 ℃ ，Ph4.5，每分鐘催化蔗糖生成1μM葡萄糖的酶量為1個酶活力單位。,DNS法測葡萄糖濃度,附圖：葡萄糖標準曲線,為了確定獲得的目標酶純不純，要進行SDS-PAGE電泳檢測；,二、實驗步驟,1.破碎細胞 取5 g干酵母，加5 g石英砂，置于預先冷卻的研缽中，加30 mL去離子水，研磨30 min，在冰箱中

10、冰凍約10 min（研磨液面上剛出現(xiàn)冰結為宜），重復2次。將研磨液轉(zhuǎn)移至大離心管中，12000 r/min離心15 min，棄去沉淀。留0.5 mL上清液為第一組分。,2.加熱除雜蛋白 將上清液轉(zhuǎn)入三角瓶，用1 mol/L醋酸溶液逐滴加入，調(diào)其pH值至5.0，然后迅速放入50℃的水浴中，保溫30 min。在溫育過程中，注意經(jīng)常緩慢攪拌液體。之后在冰浴中迅速冷卻之，以12000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，棄去沉

11、淀。留0.5 mL上清液為第二組分。,3.乙醇沉淀 量出上清液的體積，加入等體積的95%冷乙醇溶液(預先放在-20℃低溫下的時間不少于30 min)，于冰浴中溫和攪拌20 min。然后以12000 r/min的轉(zhuǎn)速離心25 min，小心棄去上清液，沉淀瀝干。將沉淀溶解在6 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH值7.3)中，攪拌(5 min以上)使其完全溶解，以12000 r/min的轉(zhuǎn)速離心25

12、min，取出0.5 mL上清液作為第三組分，剩余部分(乙醇抽提液)進行第4步操作。,4.上柱 裝DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析，用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH值7.3)平衡。將乙醇抽提液上柱，上樣后用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH值7.3)平衡，然后用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(內(nèi)含0.5 mol/L NaCl溶液，pH值7.3

13、)進行NaCl梯度(NaCl溶液濃度為0-0.5 mol/L)洗脫。,層析柱連上梯度混合器，混合器分別裝30 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH值7.3)和30 mL含有0.5 mol/L NaCl的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH值7.3)，每1 min收集1管。洗脫至混合器中液體流完為止，測定各接收管在280 nm下的光吸收值，并用尿糖試紙半定量測定各管的酶活力。收集酶活力最高的1管酶液作為第

14、四組分用于純度測定。,5.用尿糖試紙進行半定量測定： 在白瓷板每孔中分別滴3滴待測酶液，再加3滴含10％蔗糖的pH 4.5的醋酸緩沖液，攪勻，37℃放置10 min，浸入尿糖試紙，1 s后取出，60 s后比較顏色的深淺，與比色卡對照。,6. DNS法精確檢測,,試劑配制,葡萄糖標準液配制（1mg/ml）：預先將分析純葡萄糖置80℃烘箱內(nèi)約12小時。準確稱取500mg葡萄糖于燒杯中，用蒸餾水溶解后，移至500ml容量瓶中，

15、定容，搖勻（冰箱中4℃保存期約一星期）。醋酸buffer(0.2mol/L)稱取3.28g無水乙酸鈉，溶解于150ml蒸餾水，用冰乙酸調(diào)節(jié)其ph至4.5，然后定溶至200mL。10%蔗糖溶液：10g蔗糖溶解于醋酸buffer(0.2mol/L)中，定容至100ml1mol/L NaoH溶液：4gNaoH溶解于100ml蒸餾水中,四、結果分析 以梯度洗脫出的管數(shù)為橫坐標，以吸光度A280、酶活、NaCl濃度為縱坐

16、標，繪出層析曲線和酶活曲線圖。五 思考題：離子交換纖維素層析的優(yōu)點有哪些？有機溶劑抽提蛋白質(zhì)的原理是什么？,數(shù)據(jù)處理,Review Total activitySpecific activity—how to calculate it, what it means, how it changes during a purificationFold purification—what it is, how to calcula

17、te itYield—what it is, how to calculate it, how it changes during a purification,兩重要概念,1：回收率是純化后的總活力除以純化前的總活力2： 純化倍數(shù)是純化后的比活力除以純化前的比活力（第一次的比活力）注：比活力：比活力＝活力單位數(shù)／mg蛋白,實驗二 SDS-PAGE電泳,一、實驗步驟 1. 試劑配制,（1）丙烯酰胺和N, N’-亞甲雙丙烯酰胺

18、。以溫熱（利于溶解雙丙烯酰胺）的去離子水配制含有29%（w/v）丙烯酰胺和1%（w/v）N, N’-亞甲雙丙烯酰胺的貯存液 。,（2）1.5M Tris，pH8.8（分離膠緩沖液）：1.5M Tris-HCl，0.4% SDS（3）0.5M Tris，pH6.8（濃縮膠緩沖液）：0.5M Tris-HCl，0.4% SDS（4）10%過硫酸銨,以上先配！,等待凝膠聚合時再配?。?）Tris-甘氨酸電泳緩沖液(pH 8.3)：0.0

19、25M Tris，0.192M 甘氨酸，0.1% SDS（9）樣品處理液：50mM Tris-HCl(pH 6.8)，100mM DTT(or 5% 巰基乙醇)，2% SDS，0.1% 溴酚藍，10%甘油,（10）染色液：0.1% 考馬斯亮藍 R250，40% 甲醇，10% 冰醋酸（11）脫色液：10% 甲醇，10% 冰醋酸,2. SDS聚丙烯酰胺凝膠的灌制,（1）根據(jù)廠家說明書安裝玻璃板（2）確定所需凝膠溶液體積，按下表給出的數(shù)

20、值在一小燒杯中按所需丙烯酰胺濃度配制一定體積的分離膠溶液。一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應立即快速旋動混合物并進入下步操作。,（3）迅速在兩玻璃板的間隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注濃縮膠所需空間(梳子的齒長再加0.5cm)。再在膠液面上小心注入一層水（約2~3mm高），以阻止氧氣進入凝膠溶液。（4）分離膠聚合完全后（約30分鐘），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。,（5）制備濃縮膠：按下表給出的數(shù)據(jù)，在另一小燒杯中制備一定體積及

21、一定濃度的丙烯酰胺溶液，一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應立即快速旋動混合物并進入下步操作。,（6）聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠,立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。小心避免混入氣泡，再加入濃縮膠溶液以充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下。（7）在等待濃縮膠聚合時，可對樣品進行處理，在樣品中按1:1體積比加入樣品處理液，在100℃加熱3分鐘以使蛋白質(zhì)變性。,（8）濃縮膠聚合完全后（30分鐘），小心移出梳子。把凝膠固定于電泳裝置

22、上，上下槽各加入Tris-甘氨酸電極緩沖液。必須設法排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡。,3. 樣品的處理,將100ul蛋白樣品與100ul樣品處理液混合均勻，然后將此混合液在100攝氏度中水浴10min，冷卻至室溫后，12000rpm離心10分鐘，即做成電泳樣品。,4.加樣電泳,（1）按予定順序加樣，加樣量通常為10～25μl（1.5mm厚的膠）。（2）將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為8V/cm。當染料前沿進入分離膠后，把電壓提高

23、到15V/cm，繼續(xù)電泳直至溴酚藍到達分離膠底部上方約1cm，然后關閉電源。,,（3）從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮勺撬開玻璃板。緊靠最左邊一孔（第一槽）凝膠下部切去一角以標注凝膠的方位。,5.染色 經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)樣品可用考馬斯亮藍R250染色。染色1～2小時或過夜。,6.脫色,需3～10小時，其間更換多次脫色液至背景清楚 脫色后，可將凝膠浸于水中，長期封裝在塑料袋內(nèi)而不降

24、低染色強度。為永久性記錄，可對凝膠進行拍照，或?qū)⒛z干燥成膠片。此方法檢測靈敏度為0.2～1.0g。,二.結果分析,觀察并記錄實驗結果，判斷酶的純度，拍出電泳酶純度的檢驗結果。,實驗三 酵母蔗糖酶的結晶（蒸發(fā)和沉淀法相結合的懸滴蒸汽擴散結晶法）,一、原理 將含有一定鹽濃度的緩沖液與含有低于這種鹽濃度的蛋白質(zhì)混合溶液在一個密封體系內(nèi)一起蒸發(fā)擴散，最后達到平衡，使蛋白質(zhì)溶液內(nèi)鹽濃度提高，而pH值接近待結晶蛋白

25、質(zhì)等電點的緩沖液又使中性鹽對蛋白質(zhì)的鹽析作用更為顯著，因此導致蛋白質(zhì)溶解度降低，溶液逐漸達到過飽和而析出結晶。,二、實驗步驟,1.用“吹氣法”除去酒精泡洗后的24孔組織培養(yǎng)板和蓋玻片上可能帶有的灰塵，以防形成不必要的成核中心而影響晶體的觀察。,2.在24孔組織培養(yǎng)板的某孔中加入1 mL含0.2 mol/L NaCl的磷酸緩沖液（pH 6.5）作為池液,孔邊緣均勻涂抹上高真空油脂，勿使其進入孔內(nèi)。,3.吸取1 μL待結晶酶蛋白溶液置蓋玻片

26、中央, 加等體積池液至此液滴中，用槍頭輕輕地的吹吸液滴以保證混合液的均勻性并避免氣泡出現(xiàn)。,4.小心、迅速地翻轉(zhuǎn)蓋玻片并蓋在培養(yǎng)板的孔上, 旋轉(zhuǎn)45度以保證密封良好。5.室溫下靜置狀態(tài)培養(yǎng)一周以上。,三、實驗結果 一周后于體視鏡下觀察酵母蔗糖酶的晶體結構。,實驗四 蔗糖酶酶學性質(zhì)的研究,,一、實驗原理,酶學性質(zhì)的研究包括：最適溫度、最適pH、米氏常數(shù)、激活劑、抑制劑等。 一般通過單因素實驗確定。

27、,二、實驗步驟,配如下溶液：0.2mol/L磷酸氫二鈉 0.2mol/L乙酸鈉 0.2mol/L檸檬酸 0.2mol/L乙酸 0.2mol/L磷酸二氫鈉,1、最適pH的測定 （1）按下表配制緩沖溶液 將兩種緩沖試劑混合后總體積均為10ml，其溶液pH值以酸度計測量值為準。,（2） 準備二組各7支試管，第一組7支試管每支都加入0.2ml上表中相應的緩沖液，然后加入一定量的蔗糖酶。另一組7支試管也是每

28、支都加入0.2ml上表中相應的緩沖液，但不再加酶而加入等量的去離子水，分別作為測定時的空白對照管。所有的試管都用水補足到0.8ml。,4.米氏常數(shù)（Km）的測定,6. DNS法精確檢測,,（3） 所有的試管按一定時間間隔加入0.2ml蔗糖（0.2mol/L)開始反應，反應10min后分別加入1 mL 1 mol/L NaOH終止酶促反應，加水楊酸試劑1ml，沸水浴精確反應5 min,冷卻后定容至20 mL，然后測定A540的吸光值。,2

29、、最適溫度的測定 測定室溫、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、 90℃不同溫度下蔗糖酶催化和酸催化的反應速度。 每個溫度準備1支試管，以乙酸緩沖液作為緩沖液。,6. DNS法精確檢測,,（1） 確定酶的稀釋倍數(shù)，試管中加入0.2ml 0.2mol/L pH4.5的乙酸緩沖液，0.2ml稀釋的酶，加水至0.8ml 加入1ml 10%的蔗糖開始計時，在室溫下反應10min，后分別加入1 mL 1

30、mol/L NaOH終止酶促反應，加水楊酸試劑1ml，沸水浴精確反應5 min,冷卻后定容至25 mL，然后測定A540的吸光值。 須得到0.2～0.3A的吸光度，準備一個水的空白對照管用于測定所有的樣品管。,（2）測定上列各個溫度下的反應速度，每次用1支試管，均加入0.2ml乙酸緩沖液均用水調(diào)至0.8ml，放入水浴溫度下使反應物平衡30秒，加入10%蔗糖0.2ml，準確反應10分鐘，后分別加入1 mL 1 mol/L NaOH終止酶促

31、反應，加水楊酸試劑1ml，沸水浴精確反應5 min,冷卻后定容至25 mL，然后測定A540的吸光值。記錄每個水浴的準確溫度。,（3） 酶催化的各管A540 值均進行酸催化的校正。畫出酶催化的反應速度對溫度的關系曲線。,3.變性劑乙醇對游離酶活力的影響,4.米氏常數(shù)（Km）的測定,三、結果分析,1. 畫出蔗糖酶活性與pH的關系曲線。 2.畫出酶催化的反應速度對溫度的關系曲線。3.畫出乙醇對酶催化的反應速度影響的曲線。4.采用雙倒數(shù)

32、作圖法得出蔗糖酶的Km值。,實驗四 蔗糖酶的固定化,一、實驗原理,本實驗用殼聚糖固定化酵母蔗糖酶屬共價偶聯(lián)法。 為了評價固定化方法的好壞，需進行酶回收率和酶相對活力的計算。,實驗步驟,1.殼聚糖載體的制備及戊二醛的偶聯(lián)（1）稱取3 g殼聚糖溶于98 mL蒸餾水中，攪拌均勻，再滴加2 mL冰醋酸，攪拌至均勻的粘稠狀；（2）稱取8 g NaOH置大燒杯中，加入180 mL蒸餾水及20 mL甲醇。,（3）將拔出推塞的

33、注射器架在鐵架臺上，倒入粘稠狀的殼聚糖溶液，使殼聚糖溶液從20 cm高的注射器出口滴入大燒杯中，以制備殼聚糖微球載體。,（4）殼聚糖溶液滴加完畢后，靜止片刻，待微球完全沉入燒杯底部時，反復水洗多次至pH值中性，瀝干水分。加入1%戊二醛溶液100 mL，靜置2 h，使戊二醛偶聯(lián)于殼聚糖載體上。,2.固定化酶的制備（1）將靜置2 h后的殼聚糖微球載體中的戊二醛溶液倒掉，再用蒸餾水洗滌5次，以除去多余的戊二醛。（2）將實驗一純化得到的酵母

34、蔗糖酶酶液1 mL用蒸餾水稀釋至100 mL,與偶聯(lián)戊二醛的殼聚糖載體混合，靜置偶聯(lián)過夜。,3.固定化酶的評價 分別測游離酶、固定化酶以及殘留酶液的酶活力。,三. 結果分析,酶活回收率,=,—————————————,固定化酶活力,游離酶總活力,× 100%,酶的相對活力,=,—————————————————————,固定化酶活力,游離酶活力 - 殘留酶液活力,× 100%,實驗五 蔗糖酶的化學修飾,一、實

35、驗原理,N-溴代琥珀酰亞胺（NBS）能特異地修飾蛋白質(zhì)分子中色氨酸殘基的吲哚基團。 若色氨酸殘基是酶活性中心的必需基團，那么經(jīng)NBS修飾后，酶活性喪失的程度與修飾劑的濃度有化學計量關系。,在底物存在的情況下，修飾劑NBS不影響酶的活力。,P,,,,,,,,,,NH,,,,,,,,+,,,,,,N,,Br,,,,,O,O,,P,,,,,,,,,NH,,,,,,,,,,,N,,,O,,,,,,OH,+ HBr,吲哚基團