05—酶工程制藥

1、第五章 酶工程制藥,第一節(jié) 概述第二節(jié) 酶的分離純化第三節(jié) 酶和細胞的固定化第四節(jié) 固定化酶和固定化細胞的反應器第五節(jié) 酶的人工模擬第六節(jié) 酶的化學修飾第七節(jié) 酶工程研究的進展,第五章 酶工程制藥,第一節(jié) 概 述,酶工程（Enzyme Engineering）是酶學和工程學相互滲透結合、發(fā)展而形成的一門新的技術學科。它是從應用的目的出發(fā)研究酶、應用酶的特異催化性能，并通過工程化將相應原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)的技術。,酶工程簡介,

2、酶工程簡介,酶工程的名稱出現(xiàn)在20世紀20年代，主要指自然酶制劑在工業(yè)上的規(guī)模應用。 1953年，德國人提出了酶固定化技術 。1969年，日本人用固定化技術拆分了DL-氨基酸。 1971年，第一屆國際酶工程會議提出酶工程的主要內(nèi)容： 酶的生產(chǎn)、分離純化、酶的固定化、酶及固定化的反應器、酶和固定化酶的應用。,酶的基礎知識,（一）酶是生物催化劑酶是生物細胞產(chǎn)生的、具有催化能力的生物催化劑。催化高效性專一性：結構專一性；立體異構專

3、一性酶具有不穩(wěn)定性反應條件溫和,6,（二）酶的化學本質(zhì),蛋白質(zhì),酶,,單純酶,結合酶,（全酶）= 酶蛋白 + 輔因子,輔因子,,輔酶,與酶蛋白結合得比較松的小分子有機物。,輔基,與膜蛋白結合得緊密的小分子有機物。,金屬激活劑,金屬離子作為輔助因子。,7,必需基團：這些基團若經(jīng)化學修飾使其改變，則酶的活性喪失。,活性部位：酶分子中直接與底物結合，并和酶催化作用直接有關的部位。,必需基團,,活性部位,維持酶的空間結構,,結合基團,催化

4、基團,,專一性,,催化性質(zhì),現(xiàn)代酶工程的主要內(nèi)容,酶的分離純化、大批量生產(chǎn)及新酶和酶的應用開發(fā)； 酶和細胞的固定化及酶反應器的研究，包括酶傳感器、 反應檢測； 酶生產(chǎn)中基因工程技術的應用及遺傳修飾酶的研究； 酶的分子改造和化學修飾，結構與功能的研究； 有機相中酶反應的研究； 酶的抑制劑、激活劑的開發(fā)與應用研究； 抗體酶、核酸酶的研究； 模擬酶、合成酶及酶分子的人工設計、合成研究。,酶的來源,從生物體中提取分離化學合成：固

5、相合成多肽技術,早期酶的生產(chǎn)多以動植物為主要原料,植物提供的酶主要有：蛋白酶、淀粉酶、氧化酶等。動物組織提供的酶主要有：胰蛋白酶、脂肪酶和用于奶酪生產(chǎn)的凝乳酶等。不適合大規(guī)模生產(chǎn)：動植物來源有限、生產(chǎn)周期長，以及地理、氣候和季節(jié)影響。,目前工業(yè)生產(chǎn)一般都以微生物為主要來源,利用微生物生產(chǎn)酶制劑，具有如下優(yōu)點：微生物種類繁多，酶的品種齊全。微生物生長繁殖快、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高。培養(yǎng)方法簡單，原料來源豐富，價格低廉。微生物具

6、有較強的適應性和應變能力，可以通過各種遺傳變異的手段，培育出新的高產(chǎn)菌株。所以，目前工業(yè)上應用的酶大多采用微生物發(fā)酵法來生產(chǎn)。,酶的生產(chǎn)菌,作為一個優(yōu)良的產(chǎn)酶菌種應具備以下幾點要求：繁殖快、產(chǎn)酶量高，酶的性質(zhì)應符合使用要求，而且最好是產(chǎn)生胞外酶的菌。不是致病菌，在系統(tǒng)發(fā)育上與病原體無關，也不產(chǎn)生有毒物質(zhì)。這一點對醫(yī)藥和食品用酶尤為重要。產(chǎn)酶性能穩(wěn)定，不易變異退化，不易感染噬菌體。能利用廉價的原料，發(fā)酵周期短，易于培養(yǎng)。,生產(chǎn)菌

7、的來源,從菌種保藏機構和有關研究部門獲得。大量的需要要從自然界中分離篩選。自然界是產(chǎn)酶菌種的主 要來源，土壤、深海、溫泉、火山、森林等都是菌種采集地。篩選產(chǎn)酶菌的方法：采集、菌種的分離初篩、純化、復篩和生產(chǎn)性能檢定等。菌種改良的途徑：應用遺傳學原理進行基因突變、基因轉(zhuǎn)移和基因克隆。,14,目前常用的產(chǎn)酶微生物,E.coli ：是應用最廣泛的產(chǎn)酶菌。分泌胞內(nèi)酶，經(jīng)細胞破碎分離得到。在工業(yè)上用于生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天門冬氨酸酶、青霉素酰

8、化酶、β-半乳糖苷酶枯草桿菌：主要用于生產(chǎn)α-淀粉酶、β-葡萄糖氧化酶、堿性磷酸脂酶。,15,,啤酒酵母：用于釀造啤酒、酒精、飲料、面包等曲酶（黑曲酶和黃曲酶）：主要生產(chǎn)糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶。其它產(chǎn)酶菌：青霉菌、木霉菌、根霉菌、鏈霉菌等,16,酶在醫(yī)藥領域的應用,1、在疾病診斷方面的應用由于酶具有專一性強、催化效率高、作用條件溫和等顯著的催化特點，酶學診斷已經(jīng)發(fā)展成為可靠、簡便又快捷的

9、診斷方法，具有廣闊的應用前景。酶學診斷方法包括兩個方面，一是根據(jù)體內(nèi)原有酶活力的變化來診斷某些疾病，二是利用酶來測定體內(nèi)某些物質(zhì)的含量，從而診斷某些疾病。,17,（一）根據(jù)體內(nèi)酶活力的變化診斷疾病 一般健康人體內(nèi)所含有的某些酶的量是恒定在某一范圍的。當人們患上某些疾病時，則由于組織、細胞受到損傷或者代謝異常而引起體內(nèi)的某種或某些酶的活力發(fā)生相應的變化。故此，可以根據(jù)體內(nèi)某些酶的活力變化情況，而診斷出某些疾病。

10、,,,,,20,（二）用酶測定體液中某些物質(zhì)的變化診斷疾?。?人體在出現(xiàn)某些疾病時，由于代謝異常或者某些組織器官受到損傷，就會引起體內(nèi)某些物質(zhì)的量或者存在部位發(fā)生變化。通過測定體液中某些物質(zhì)的變化，可以快速、準確地對疾病進行診斷。酶具有專一性強、催化效率高等特點，可以利用酶來測定體液中某些物質(zhì)的含量變化，從而診斷某些疾病。,,,22,2、在疾病治療方面的應用——酶類制劑 酶可以作為藥物治療多種疾病，用于治療疾

11、病的酶稱為藥用酶。藥用酶具有療效顯著，副作用小的特點，在疾病的治療方面的應用越來越廣泛,24,消化類：研究最早，是品種最多的一類酶.在這一類酶中主要有胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、纖維素酶、木瓜酶、凝乳酶、無花果酶、菠蘿酶等。,健美生消化酶—幫助腸胃蠕動,25,抗炎凈創(chuàng)類：目前在治療上發(fā)展最快，用途最廣的一種。多數(shù)是蛋白質(zhì)水解酶，分解發(fā)炎部位纖維蛋白的凝結物，消除傷口周圍的壞疽、腐肉和碎屑。其中有些酶能夠分解膿液中的核蛋白使成簡單的嘌呤

12、和嘧啶，降低膿液的粘性、達到凈潔創(chuàng)口、消除癡皮、排除膿液抗炎消腫的目的。主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、雙鏈酶，α-淀粉酶、胰脫氧核糖核酸酶等。,26,血凝和解凝類：這類酶都是從血液中提取出來的。凝血酶的作用是促使血中纖維蛋白元變成不溶性纖維蛋白,從而促使血液凝固，防止微血管出血。纖維蛋白溶解酶的作用是溶解血塊，為目前臨床上最新的一種酶制品,治療血栓靜脈炎、冠狀動脈栓塞等。抑肽酶作為肽酶抑制劑，廣泛應用于體外循環(huán)手術，大劑量抑肽酶可明

13、顯減少心臟外科手術后的滲血，消除因心臟外科手術后滲血而導致的死亡,27,解毒類：主要作用是解除體內(nèi)或因注射某種藥物產(chǎn)生的一種有害物質(zhì)。主要品種有青霉素酶、過氧化氫酶和組織胺酶等。青霉素酶能夠分解青霉素分子中的β一內(nèi)酰胺環(huán)，使變成青霉噻唑酸，消除因注射青霉素引起的過敏反應。,28,3、在藥物生產(chǎn)方面的應用利用酶的催化作用將前體物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樗幬?。這方面的應用日益增多?，F(xiàn)已有不少藥物包括一些貴重藥物都是由酶法生產(chǎn)的 4.在分析檢測方面的

14、應用酶法檢測或酶法分析如：ELISA、免疫組織化學、Western blot中的HRP,,,第二節(jié) 酶的分離純化,細胞破碎酶的提取酶的分離方法酶的組合分離純化策略酶的濃縮、干燥與結晶,31,一、酶的分離純化技術路線,細胞破碎,酶提取,酶分離純化,,,酶濃縮,,,酶貯存,動物、植物或微生物細胞,,發(fā)酵液,,離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結晶分離等。,32,二、酶的提取,（一） 細胞破碎許多酶存

15、在于細胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對細胞進行破碎處理。1）機械破碎2）物理破碎3）化學破碎4）酶解破碎,JY92-II D超聲波細胞粉碎機,細胞破碎珠,高壓細胞破碎機,DY89-I型 電動玻璃勻漿機,33,采用緩沖體系：以防pH值大幅度變化而失活添加保護劑：防活性基團活性中心受影響抑制水解酶的作用其它保護措施：溫度，pH值，攪拌，光照，氧化等影響,34,（二）酶的抽提,35,(三）沉淀分離,36,三、酶的純化,過濾

16、與膜分離電泳離子交換層析,第三節(jié) 酶和細胞的固定化,38,酶應用過程中的一些不足,酶的穩(wěn)定性較差：除了某些耐高溫的酶，如α-淀粉酶、Taq酶等；和胃蛋白酶等可以耐受較低的pH條件以外，大多數(shù)的酶在高溫、強酸、強堿和重金屬離子等外界因素影響下，都容易變性失活。 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中與底物反應，這樣酶在反應系統(tǒng)中，與底物和產(chǎn)物混在一起，反應結束后，即使酶仍有很高的活力，也難于回收利用。這種一次性使用酶的方式，不僅使生產(chǎn)成

17、本提高，而且難于連續(xù)化生產(chǎn)。 產(chǎn)物的分離純化較困難：酶反應后成為雜質(zhì)與產(chǎn)物混在一起，無疑給產(chǎn)物的進一步的分離純化帶來一定的困難。,,固定化技術,固定化技術就是為了克服酶在工業(yè)應用中的不足，使酶催化反應能像化學催化劑一樣在多相反應過程中穩(wěn)定操作，并易于回收和反復使用而發(fā)展起來的一項酶化學與酶工程技術。,39,固定化酶簡介,1916年，Nelson和Griffin最先發(fā)現(xiàn)了酶的固定化現(xiàn)象。固定化酶的研究從20世紀50年代開始，1953年

18、德國的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯樹脂為載體，經(jīng)重氮化法活化后，分別與羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核酸核糖酶等結合，制成固定化酶。20世紀60年代后期，固定化技術迅速發(fā)展。1969 年，日本千佃一郎首次應用固定化氨基?；笍幕旌习被嶂写笠?guī)模生產(chǎn)L-氨基酸，實現(xiàn)了酶應用史上的一大變革，開辟了固定化酶工業(yè)化應用的新紀元。這時人們已經(jīng)預感到了固定化酶以后可以在現(xiàn)代酶工程以及整個生物工程中占有的重要作用, 它在應用上和

19、理論上的巨大潛力吸引了生物化學、微生物學、醫(yī)學、化學工程和高分子等領域的科研機構及企業(yè)科技部門研究人員的注意力。,40,從1970年代初開始酶的固定化技術研究發(fā)展很快，促使酶工程作為一個獨立學科從發(fā)酵工程中脫穎而出，才真正登上歷史舞臺。至1980年代初，每年約發(fā)表1000篇以上的文獻和近200篇專利，所報道的固定化方法達100種以上。1980年代中以后，酶和細胞固定化研究的發(fā)展速度開始減慢，從而有人認為，對酶的固定化技術應予以重新評價

20、，理由是盡管已經(jīng)做了大量研究工作，但工業(yè)中實際應用的案例尚少，經(jīng)過近20年的研究，真正能獲得規(guī)模應用的固定化酶，還僅局限于葡萄糖異構酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等為數(shù)不多的幾個酶種。,41,我國的固定化酶研究開始于1970 年, 首先是微生物所和上海生化所的酶學工作者同時開始了固定化酶的研究工作。對于固定化酶，曾經(jīng)有過固相酶、水不溶酶、固定酶等多種名稱。在1971年召開的第一次國際酶工程學術會議上，確定固定化酶的統(tǒng)一英文名稱為imm

21、obilized enzyme。,（一）固定化酶的制備,1、固定化酶（immobilized enzyme）的定義：指限制或固定于特定空間位置的酶。具體講是指經(jīng)物理或化學方法處理，使酶變成不易隨水流失即運動受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是純化的酶，也可以是結合在菌體（死細胞）或細胞碎片上的酶或酶系。,2、固定化酶的特點,可以多次使用，酶的穩(wěn)定性提高；反應后，酶與底物和產(chǎn)

22、物易于分開，產(chǎn)物中無殘留酶，易于純化。反應條件易于控制，可實現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應的連續(xù)化和自動控制；酶的利用率高，單位酶催化的底物量增加，用酶量少；比水溶性酶更適合于多酶反應。,固定化酶缺點,固定化時，酶活力有損失增加了生產(chǎn)成本、初始投資大只能用于可溶性底物，而且較適于小分子底物，不適宜大分子底物胞內(nèi)酶必須經(jīng)過酶的分離純化于完整菌體相比不適宜多酶反應，特別是需要輔助因子的反應,3、酶和細胞固定化方法,酶的固定化（enzyme imm

23、obilization）是指采用有機或無機固體材料作為載體，將酶包埋起來或束縛、限制于載體的表面和微孔中，使其仍具有催化活性，并可回收及重復使用的酶化學方法與技術。不使用固體材料作為載體，通過酶分子之間的相互交聯(lián)形成聚集體，也可將酶固定化，稱為無載體酶固定化．1990年代初報道的交聯(lián)酶晶體（cross—linked enzyme crystals，CLEC）就屬于無載體固定化酶 。,酶和細胞的固定化方法,,酶和細胞固定化模式,（1）載

24、體結合法,將酶結合于不溶性載體上的固定化方法。A、物理吸附法：用物理方法將酶吸附于不溶性載體上的固定化方法。載體如：活性碳、多孔玻璃、樹脂等。優(yōu)點：操作簡單，可選用不同電荷和不同形狀的載體，有可能固定化和純化過程同時實現(xiàn)，酶失活后載體仍可再生。缺點：最適吸附酶量無規(guī)律可循，吸附量與酶活力不一定呈平行關系，酶與載體結合力不強，酶易于脫落，導致酶活下降并污染產(chǎn)物，故不常用。,49,B、離子結合法：酶通過離子鍵結合于具有離子交換基的水不

25、溶性載體上。如：DEAE-纖維素。優(yōu)點：操作簡單，處理條件溫和，酶的高級結構和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞。缺點：載體和酶的結合力弱，易受緩沖液種類或pH的影響，離子強度高時，酶易脫落。,離子交換劑結合蛋白能力較強，故常用,50,C、共價結合法：酶以共價鍵結合于載體上。即將酶分子上非活性部位功能團與載體表面反應基團進行共價結合的方法。優(yōu)點：酶與載體結合牢固，穩(wěn)定性好，不易脫落。(目前研究最為活躍的一類酶固定化方法 )缺點：載體

26、要活化，反應條件苛刻，操作復雜，反應條件劇烈，酶易失活和產(chǎn)生空間位阻效應,常常會引起酶蛋白高級結構發(fā)生變化，并導致活性中心受到破壞,難以得到比活高的固定化酶，甚至底物的專一性等性質(zhì)也可能發(fā)生變化。,載體結合法 注意事項,首先要注意載體活化，使載體獲得能與酶分子的某一特定基團發(fā)生特異反應的活潑基團?；罨椒ㄓ絮；?、芳基化、烷基化和氨甲?；磻取Ｃ傅鞍咨蠀⑴c共價結合的氨基酸殘基不應該是酶催化活性所必需的，避免固定化后酶活力喪失。反應

27、條件盡可能溫和。,（2）交聯(lián)法,采用雙功能團試劑或多功能團試劑進行酶分子之間的交聯(lián)，使酶分子和雙功能團試劑或多功能團試劑之間形成共價鍵，得到三維的交聯(lián)網(wǎng)狀結構．常用的交聯(lián)劑：戊二醛、雙重氮聯(lián)苯胺-2、2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯。,53,酶分子之間共價交聯(lián)和與水不溶性載體共價結合 酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團的化學交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶,交

28、聯(lián)法又分：交聯(lián)酶法、酶與輔助蛋白交聯(lián)法、吸附交聯(lián)法和載體交聯(lián)法。交聯(lián)法反應條件劇烈，固定化酶的酶活回收率低（故盡可能降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應時間），會引起酶活性中心結構的改變，導致酶活性降低（常加入輔助蛋白如牛血清蛋白提高固定化酶的穩(wěn)定性），因此常與吸附法或包埋法聯(lián)合使用。,（3）包埋法,包理法是將酶包裹于凝膠形成的網(wǎng)絡結構中，或半透膜聚合物的超濾膜內(nèi)使其固定化。適用于多種酶、粗酶制劑、細胞器和細胞的固定化。包埋法一般不需要與酶蛋白

29、的氨基酸殘基進行結合反應，很少改變酶的空間構象，酶活回收率較高，因此可以應用于許多酶的固定化。但是包埋法制備的固定化酶，只適合用于小分子底物和產(chǎn)物的酶催化反應，因為只有小分子反應底物或產(chǎn)物，才可以通過高分子凝膠的網(wǎng)格進行擴散。由這種固定化方法產(chǎn)生的擴散阻力，還會使固定化酶的動力學行為發(fā)生改變，從而降低酶活力。包埋法可分為網(wǎng)絡型和微囊型兩種。前者是將酶包埋于高分子凝膠細微網(wǎng)絡內(nèi)；而后者是將酶包埋在高分子半透膜中制備成微囊型。,56,A、

30、網(wǎng)格型：將酶或細胞包埋在高分子凝膠細微網(wǎng)格中。常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏樹脂。天然高分子化合物有淀粉、明膠、膠原、海藻膠、角叉菜膠。多用于固定化細胞,57,B、微囊型：將酶或細胞包埋在高分子半透膜中。通常為直徑幾微米到幾百微米的球狀體。顆粒比網(wǎng)格型要小得多，比較有利于底物與產(chǎn)物的擴散，但反應條件要求高，制備成本也高。,①海藻酸鈉與CaCO3（“蛋盒”模型，形成熱不可逆凝膠）；②殼聚糖（陽離子胺基）與海藻酸鈉，通

31、過正負電荷吸引，產(chǎn)生瞬時凝膠化作用，形成聚電解質(zhì)半透膜；③殼聚糖胺基與戊二醛基形成shiff氏堿，在膠囊表面形成一層致密的保護膜，可增加微膠囊球的強度，能有效的防止磷脂酶從微膠囊中泄漏，而提高固定化酶的活力回收。,,,不同磷脂酶作用于磷脂部位示意圖,,,,（4） 選擇性熱變性法,專用于細胞固定化，是將細胞在適當溫度下處理使細胞膜蛋白變性但不使酶變性而使酶固定于細胞內(nèi)的方法。,4、酶和細胞的固定化載體,載體條件：固定化過程中不引起酶變

32、性對酸堿有一定的耐受性有一定的機械強度有一定的親水性和良好的穩(wěn)定性有一定的疏松網(wǎng)狀結構，顆粒均勻共價結合時具有可活化基團有耐受酶和微生物細胞的能力價廉易得、經(jīng)濟環(huán)保固定化載體主要有三類：吸附載體、包埋載體和共價結合載體,5、新型的酶固定化方法,溫和的條件下進行，減少酶活力損失，提高固定化效率光偶聯(lián)法：光敏性單體聚合物包埋固定化酶或帶光敏性基團的載體共價固定化酶等離子體法：高度激發(fā)的原子、分子，自由基的聚集體，載體表面

33、用等離子體修飾，引入活性基團,無載體固定化酶直接用交聯(lián)劑交聯(lián) 用交聯(lián)劑交聯(lián)溶解酶、晶體酶、物理聚集酶、和噴霧干燥酶等四種無載體酶體系，優(yōu)點如下： 催化活性高，成本低 具備較高的催化劑比表面 可加入多種酶 底物擴散受限制少 極端條件下穩(wěn)定性高,（二）固定化細胞,通過各種方法將細胞與水不溶性的載體結合，制備固定化細胞的過程稱為細胞固定化。固定化細胞是指固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進行生命活動的細胞。

34、固定化細胞能進行正常的生長、繁殖和新陳代謝，故也稱為固定化活細胞、固定化增值細胞、第二代固定化酶。微生物細胞、植物細胞和動物細胞都可以制成固定化細胞。固定化細胞可以提高生產(chǎn)效率，延長生產(chǎn)周期，并易于細胞的分離和回收。目前，固定化細胞技術已應用于食品工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)和三廢處理工業(yè)，經(jīng)濟效益顯著。,65,固定化細胞簡介,固定化酶和固定化菌體的應用進一步推動了固定化技術的發(fā)展。20世紀70年代后期出現(xiàn)固定化細胞技術。由于固定化細胞技術不需要把

35、酶從細胞中提取出來，酶活力損失少，酶活回收率較高,因此該技術的應用已經(jīng)超過固定化酶的應用。細胞被固定化后細胞密度高、反應速度快、耐毒害能力強、產(chǎn)物分離容易、能實現(xiàn)連續(xù)操作，可以大大提高生產(chǎn)能力等優(yōu)勢，因此在近幾十年來固定化細胞技術得到了迅速的發(fā)展和廣泛的應用。通常只能用于胞外酶等胞外產(chǎn)物的生產(chǎn)。 1959 年Hattori首次將大腸桿菌E. coli 吸附在樹脂上實現(xiàn)細胞固定化，隨后固定活細胞或稱為固定化增殖細胞的研究工作相繼展開。

36、1973年, 含有L- 天冬氨酸酶的微生物被固定化, 并用于L- 天冬氨酸的生產(chǎn)。,66,1976年，法國首次用固定化酵母細胞生產(chǎn)啤酒和酒精。1978年，日本固定化枯草桿菌細胞生產(chǎn)α-淀粉酶；1984年，中國開始進行固定化細胞生產(chǎn)α-淀粉酶、糖化酶和果膠酶等的研究。 20世紀70年代中期以來，動植物細胞培養(yǎng)技術迅速發(fā)展。動物細胞主要用于生產(chǎn)疫苗、抗體、多肽藥物、酶等功能蛋白質(zhì)，其中大多數(shù)動物細胞具有貼壁生長的特性，采用固定化動物細

37、胞培養(yǎng)技術，更加具有重要意義。植物細胞也可以采用固定化植物細胞培養(yǎng)。動植物細胞固定化的研究和應用進一步擴展了固定化技術的研究、開發(fā)。近年來還開展了固定化動植物細胞生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物的研究工作。,67,固定化細胞的優(yōu)點,①無需進行酶的分離純化，節(jié)約酶的分離過程及費用; ②屬于多酶系統(tǒng)，可催化一系列反應，無需輔酶再生; ③細胞生長停滯時間短，抗污染能力強; ④固定化細胞可以重復或長期使用，簡化游離細胞培養(yǎng)過程，還減少了營養(yǎng)基質(zhì)的浪費;

38、 ⑤保持酶的原始狀態(tài)，提高酶的穩(wěn)定性; ⑥使用固定化細胞反應塔連續(xù)發(fā)酵，可以避免反饋抑制和產(chǎn)物的消耗。,68,固定化細胞的缺點,①部分載體材料有時會對細胞產(chǎn)生生理毒性，將導致細胞死亡，菌體自溶，影響產(chǎn)物的純度或影響目標代謝產(chǎn)物的生物合成;②細胞膜或細胞壁會造成底物滲透和擴散的障礙; ③有些載體材料使細胞或小細胞群體相互分隔，容易形成不利于細胞之間彼此協(xié)調(diào)的環(huán)境，影響代謝產(chǎn)物的生物合成; ④大規(guī)模制備固定化細胞過程復雜，易引起雜

39、菌污染; ⑤細胞內(nèi)有多種酶存在，會形成副產(chǎn)物; ⑥載體材料使成本提高，以至于該技術在傳統(tǒng)的發(fā)酵工業(yè)中難以推廣。,固定化細胞的制備技術,細胞固定化主要適用于胞內(nèi)酶，要求底物和產(chǎn)物透過細胞膜，細胞內(nèi)不存在產(chǎn)物分解系統(tǒng)及其他副反應。載體結合法、包埋法、交聯(lián)法、無載體法,（1）載體結合法制備技術,將細胞懸浮液直接與水不溶性載體相結合。載體主要為陰離子交換樹脂、陰離子交換纖維素、聚氯乙烯。優(yōu)點：操作簡單，符合細胞的生理條件，不影響細胞的生

40、長及酶活性。缺點：吸附容量小、結合強度低。,（2）包埋法制備技術,與包埋酶法相同，將細胞定位于凝膠網(wǎng)格內(nèi)。是固定化細胞中應用最多的方法。常用載體有卡拉膠、聚乙烯醇、瓊脂等。優(yōu)點：細胞容量大，操作簡便，酶的活力回收率高缺點：擴散阻力大，容易改變酶的動力學行為，不適于催化大分子底物與產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化反應。,（3）交聯(lián)法制備技術：由于所用交聯(lián)劑戊二醛等對細胞有毒性，一般很少用。（4）無載體法制備技術：靠細胞自身的絮凝作用制備固定化細胞的技

41、術。通過助凝劑或選擇性熱變性的方法實現(xiàn)細胞的固定化?？梢垣@得高密度細胞，固定化條件溫和，但是機械強度差。此外還有粘合法，截留法等,73,（三）固定化方法與載體的選擇依據(jù),酶可以通過各種不同的方法進行固定化，但不管是通過物理的弱相互作用，還是通過較強的化學鍵結合，都必須采用不溶于水的材料作為固定化載體。任何一種固定化方法或固定化載體，都不可能適用于所有的酶，要想獲得較好的固定化效果，必須根據(jù)具體的酶和催化反應類型，選擇合適的固定化方法

42、和載體。和多相化學催化劑的制備一樣，要想通過選擇固定化方法和載體，制備出性能最佳的固定化酶，沒有現(xiàn)成的規(guī)律可循，往往依賴于實際工作經(jīng)驗的積累，最后以是否能最大限度地保留酶活性和提高酶的穩(wěn)定性為評價標準。,固定化方法的選擇依據(jù),（1）固定化酶應用的安全性：要按照藥物和食品領域的檢驗標準作必要的檢查。所用試劑是否有毒性和殘留。盡可能選擇無毒性試劑。（2）固定化酶在操作中的穩(wěn)定性：在選擇固定化方法時要求固定化酶在操作過程中十分穩(wěn)定，能長期

43、反復使用，在經(jīng)濟上有極強的競爭力。（3）固定化的成本：包括酶、載體、試劑的費用，也包括水、電、氣、設 備和勞務投資等。注意綜合考慮。,（四）固定化酶（細胞）的性質(zhì)與指標,1、固定化酶的形狀不同材料可以制成相同形狀固定化酶，如卡拉膠、瓊脂等均可制成酶片或酶塊；同種材料也可以制成不同形狀的固定化酶，如海藻膠可以制成酶片或酶塊或酶珠。同種方法可以制成不同形狀，如包埋法可以制造酶珠、酶膠囊；而不同方法也可以制成相同形狀，如交聯(lián)法、吸附法和

44、共價法均可制造酶粉。因此，固定化酶形狀是由底物和產(chǎn)物的性質(zhì)、基質(zhì)材料的性能、固定化方法、酶反應性質(zhì)、反應器類型或應用目的決定的。,（1）顆粒狀：包括酶珠、酶塊、酶片、酶粉。每種固定化方法均可制備顆粒狀，方法簡單，比表面積大，轉(zhuǎn)化效率高，適用各種反應器。如酵母酶珠。（2）纖維狀：三醋酸纖維素用適當?shù)娜軇┤芙夂笈c酶混合，再用噴絲的方法就可制成酶纖維。比表面積大，轉(zhuǎn)化效率高，但只適用于填充床反應器。此外，纖維酶可以織成酶布用于填充床反應器

45、。,（3）膜狀固定化酶：可通過共價結合的方法將酶偶聯(lián)在濾膜上。也可用交聯(lián)等其他方法制膜酶。酶膜比表面積大，滲透阻力小，可用于酶電極，破碎后也可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶、脲酶等酶膜。（4）管狀固定化酶：又稱酶管，利用管狀載體如尼龍、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，經(jīng)活化后與酶偶聯(lián)得酶管。酶管的機械強度大，切短后可用于填充床反應器，也可組裝成列管式反應器。目前已制備出糖化酶、轉(zhuǎn)化酶、脲酶等酶管。,2、固定化酶的性質(zhì)酶

46、經(jīng)過固定化后，其催化反應體系由均相轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷?。由于固定化方法和所用載體的不同，固定化酶受到擴散限制、空間障礙、微環(huán)境變化和化學修飾等因素的影響，從而導致酶學性質(zhì)和酶活力的變化。,（1）酶活力的變化：酶經(jīng)過固定化之后活力大都下降。原因主要：①酶活性中心的重要氨基酸與載體發(fā)生結合，酶的空間結構發(fā)生變化；②酶與底物結合時存在空間位阻效應，影響活性中心對底物的定位；③包埋法中酶被高分子物質(zhì)包圍，大分子物質(zhì)不能透過膜，導致底物與產(chǎn)物擴散阻力增

47、大。解決辦法：反應條件盡可能溫和；加入抑制劑、底物或產(chǎn)物保護酶活性中心。但是，由于偶聯(lián)過程中酶得到化學修飾，或固定化過程中提高了酶的穩(wěn)定性，某些酶在固定化后酶活力得到提高。,（2）酶穩(wěn)定性的變化：穩(wěn)定性包括對溫度、pH、蛋白酶變性劑和抑制劑的耐受程度。固定化后，穩(wěn)定性提高，有效壽命延長。其原因是限制了酶分子之間的相互作用，阻止其自溶，增加酶構型的牢固程度。但是，當固定化過程影響到酶活性中心和酶的高級結構的敏感區(qū)域，也將導致酶活性

48、降低。,a、熱穩(wěn)定性提高：熱穩(wěn)定性越高，工業(yè)化意義越大。熱穩(wěn)定性高可以提高反應溫度和反應速度，提高效率。b、操作穩(wěn)定性：實際應用的關鍵所在，通常用半衰期表示。半衰期達到1個月以上時，即具有工業(yè)應用價值。c、貯藏穩(wěn)定性：一般不能長期貯存，現(xiàn)做現(xiàn)用，否則活力逐漸下降。若需長期保存，可在貯存液中添加底物、產(chǎn)物、抑制劑和防腐劑，并于低溫保存。d、對蛋白酶的穩(wěn)定性：大多數(shù)天然酶經(jīng)固定化后對蛋白酶的耐受力有所提高，有利于工業(yè)化生產(chǎn)?？赡艿脑?/p>

49、是由于空間位阻效應使蛋白酶不能進入固定化酶內(nèi)部。,（3）酶學特性的變化 A、底物專一性：由于位阻效應，對底物的專一性明顯下降。 B、最適pH：最適pH可能變大，也可能變??；pH-酶活曲線可能發(fā)生變化，其變化與酶蛋白和載體的帶電性質(zhì)有關。帶負電荷的載體使pH偏大；帶正電荷的載體使之偏??；中性載體通常不改變最適pH。pH-酶活曲線與游離酶相比，或保持相同的鐘罩型、或變得更陡、或更平坦。,C、最適溫度：一般升高。原因是固定化后空間結構

50、更為穩(wěn)定。有些酶不變或下降，如多空玻璃共價結合的葡萄糖異構酶和亮氨酸氨肽酶的最適溫度與游離酶一樣。D、米氏常數(shù)（Km） ：Km值均發(fā)生變化，有的增加很小，有的增加很大，但不會變小。當?shù)孜餅榇蠓肿訒r，采用包埋法固定則Km增加較大；底物為小分子時， Km變化不大。E、最大反應速度（Vm）：變化很小或不變。,,,3、固定化細胞的性質(zhì),細胞的固定化，需要采用適當措施提高細胞膜的通透性來提高胞內(nèi)酶的活力和轉(zhuǎn)化效率。固定化細胞與固定化酶的性質(zhì)基

51、本相似。最適pH變化無特定規(guī)律最適溫度一般與游離細胞相同，但個別也會提高。穩(wěn)定性一般會提高，因此決定其工業(yè)的廣泛應用。,（五）評價固定化酶（細胞）的指標,1、固定化酶活力測定單位時間內(nèi)，單位體積中的底物減少量或產(chǎn)物增加量表示。對底物或產(chǎn)物具有光吸收、旋光、電位差或熒光性質(zhì)的變化，可以直接測定。對不能通過底物或產(chǎn)物的變化量來測定其活力的反應，可通過與其產(chǎn)物相偶聯(lián)的酶促反應來測定活力。,根據(jù)固定化酶的反應系統(tǒng)，活力測定可分為分批

52、測定和連續(xù)測定。分批測定：固定化酶在攪拌或震蕩情況下進行，間隔一定時間取樣，過濾后按常規(guī)方法測定。測定結果與反應器形狀、大小、反應液數(shù)量、攪拌和震蕩速度有關。速度加快，活力增加，但增加到一定活力后會恒定；攪拌過快會導致固定化酶破碎，因此要嚴格控制反應條件。連續(xù)測定：引出反應液到流動比色杯中進行分光測定；或在連續(xù)流反應器中，根據(jù)底物的流入速度和反應速度之間的關系計算酶活力，此時注意反應器形狀對反應速度的影響。,影響酶活力測定的因素很多

53、，如測定環(huán)境、pH、溫度、離子強度、酶濃度、震蕩和攪拌速度以及固定化酶顆粒大小變化等，為確?？杀刃?，必須嚴格控制反應條件的一致性。實際應用中，測定條件應盡可能與實際工藝條件相同。,2、偶聯(lián)率及相對活力的測定活力回收率=固定化酶總活力/加入酶的總活力相對活力＝固定化酶總活力/（加入酶的總活力－上清液中未偶聯(lián)的酶活力）偶聯(lián)率＝（加入酶活力－上清液酶活力）/加入蛋白活力 偶聯(lián)率=1，表示反應控制好，固定化或擴散限制引起的酶失

54、活不明顯；1時，有細胞分裂或從載體排除抑制劑等因素影響。,,3、半衰期，即酶的活力降為初活力一半時所經(jīng)歷的連續(xù)操作時間，用T1/2表示。4、熱穩(wěn)定性：將固定化酶在不同溫度下溫育1 h，在最適溫度下測酶活力，一般保持在60%以上。,（七）酶傳感器,（一）原理它將活性物質(zhì)酶覆蓋在電極表面，酶與被測的有機物或無機物反應，形成一種能被電極響應的物質(zhì)。1967年Updick和Hicks將固定化的葡萄糖氧化酶膜結合在氧電極上，做成了第一支葡萄

55、糖電極；此后，這類酶傳感器通常是通過檢測產(chǎn)物H2O2的濃度變化或氧的消耗量來檢測底物。,,,,,,用葡萄糖氧化酶電極測定血液、尿、發(fā)酵液中的葡萄糖濃度；用脲酶電極測定血液中的尿素濃度,酶傳感器主要類型,酶催化特定底物發(fā)生反應，從而使特定生成物的量有所增減.用能把這類物質(zhì)的量的改變轉(zhuǎn)換為電信號的裝置和固定化酶耦合，即組成酶傳感器.依據(jù)信號轉(zhuǎn)換器的類型,酶傳感器大致可分為酶電極(主要包括離子選擇電極、氣敏電極、氧化還原電極等電化學電極)

56、、酶場效應晶體管傳感器(FET-酶)和酶熱敏電阻傳感器等。,離子敏場效應晶體管酶傳感器（ISFET）對離子或分子敏感的半導體器件ISFET與常用的絕緣柵型場效應晶體管構造相同．不過在輸入柵極做了一些改進，以能與特定的化學物質(zhì)反應，產(chǎn)生電位的酶膜取代金屬極．讓酶膜直接與溶液接觸，由于酶膜對溶液中的離子有選擇作用，從而調(diào)制ISFET的漏電流變化，利用這個特性就能檢測一溶液中的離子活度．,第四節(jié) 固定化酶和固定化細胞的反應器,固定化酶和固

57、定化細胞能否用于工業(yè)化生產(chǎn)，關鍵取決于酶反應器的設計和選擇,1、什么是酶反應器,2、酶反應器類型及特點,3、酶反應器的選擇,Go,Go,Go,99,1、什么是酶反應器,迄今，人們已發(fā)明了把酶固定化的多種技術?？梢允姑概c之結合的固體材料，常用的有纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、高分子聚合物及多孔無機材料等等。人們把這些材料制成含有大量空隙的形態(tài)，使其具有較大的表面積。在一定的條件下，酶可以與這些材料以物理吸附、化學鍵形成或生物特異性結合等方式結

58、合，有時也可以是固體材料網(wǎng)絡把酶包起來。將這些結合了酶的載體材料裝填成柱或別的形式的反應裝置，再配以進出料及其他條件的控制設備，便成了一種新型的反應器--固定化酶生物反應器。,100,用于酶進行催化反應的容器及其附屬設備稱為酶反應器。,酶反應器是根據(jù)酶的催化特性而設計的反應設備。其設計的目標就是生產(chǎn)效率高、成本低、耗能少、污染少，以獲得最好的經(jīng)濟效益和社會效益。,酶反應器是用于完成酶促反應的核心裝置。它為酶催化反應提供合適的場所和最佳的

59、反應條件，以便在酶的催化下，使底物（原料）最大限度地轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。它處于酶催化應過程的中心地位，是連接原料和產(chǎn)物的橋梁。,101,酶催化反應過程示意圖,102,理想的酶反應器要求,生物反應器設計的主要目標：使產(chǎn)品的質(zhì)量最高，生產(chǎn)成本最低。評價生物反應器的主要標準：反應器生產(chǎn)能力的大小和產(chǎn)品質(zhì)量的高低。,,(4) 應具有最佳的無菌條件，否則，雜菌污染使反應器的生產(chǎn)能力下降。,(1) 所用生物催化劑應具有較高的比活和酶濃度（或細胞濃度）

60、，才能得到較大的產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率。,(2) 能用電腦自動檢測和調(diào)控，從而獲得最佳的反應條件。,(3) 應具有良好的傳質(zhì)和混合性能。傳質(zhì)是指底物和產(chǎn)物在反應介質(zhì)中的傳遞。傳質(zhì)阻力是反應器速度限制的主要因素。,103,2、酶反應器類型及特點,酶反應器的種類有常用于飲料和食品加工工業(yè)的攪拌罐型反應器，使用最廣泛的固定化酶反應器的固定床型反應器，適合于生化反應的膜式反應器等。,104,常見的酶反應器類型,按結構區(qū)分攪拌罐式反應器（Stirred T

61、ank Reactor, STR）鼓泡式反應器(bubble column reactor, BCR )填充床式反應器(packed column reactor, PCR )流化床式反應器( Fluidized Bed Reactor, FBR)膜反應器(Membrane Reactor, MR) 按操作方式區(qū)分分批式反應(batch )連續(xù)式反應(continuous )流加分批式反應(feeding batch )

62、 按二者混合形式區(qū)分連續(xù)攪拌罐反應器（Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR）分批攪拌罐反應器（Batch Stirred Tank Reactor, BSTR）,105,(1)間歇式酶反應器,又稱為批量反應器（Batch Reactor BSTR）、間歇式攪拌罐、攪拌式反應罐。其特點是：底物與酶一次性投入反應器內(nèi)，產(chǎn)物一次性取出；反應完成之后，固定化酶（細胞）用過濾法或超濾法回收，再轉(zhuǎn)入下一批

63、反應。 優(yōu)點是：裝置較簡單，造價較低，傳質(zhì)阻力很小，反應能很迅速達到穩(wěn)態(tài)。缺點是：操作麻煩，固定化酶經(jīng)反復回收使用時，易失去活性，故在工業(yè)生產(chǎn)中，間歇式酶反應器很少用于固定化酶，但常用于游離酶。,106,(2)連續(xù)式酶反應器,又稱為連續(xù)攪拌釜式反應器（Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR）、連續(xù)式攪拌罐。向反應器投入固定化酶和底物溶液，不斷攪拌，反應達到平衡之后，再以恒定的流速連續(xù)流入底物

64、溶液，同時，以相同流速輸出反應液（含產(chǎn)物）。與BSTR的區(qū)別：連續(xù)進料、連續(xù)出料。優(yōu)點是：在理想狀況下，混合良好，各部分組成相同，并與輸出成分一致。缺點是：攪拌漿剪切力大，易打碎磨損固定化酶顆粒。,底物溶液進口,反應液出口,107,(3)填充床反應器,填充床反應器（Packed Reactor,PBR）,又稱固定床反應器。將固定化酶填充于反應器內(nèi)，制成穩(wěn)定的柱床，然后，通入底物溶液，在一定的反應條件下實現(xiàn)酶催化反應，以一定的流速，

65、收集輸出的轉(zhuǎn)化液（含產(chǎn)物）。優(yōu)點是：高效率、易操作、結構簡單等，因而，PBR是目前工業(yè)生產(chǎn)及研究中應用最為普遍的反應器。它適用于各種形狀的固定化酶和不含固體顆粒、黏度不大的底物溶液，以及有產(chǎn)物抑制的轉(zhuǎn)化反應。缺點是：傳質(zhì)系數(shù)和傳熱系數(shù)相對較低。當?shù)孜锶芏群腆w顆?；蝠ざ群艽髸r，不宜采用PBR。,108,(4)流化床反應器,流化床反應器（Fluidized Bed Reactor, FBR）。特點是：底物溶液以足夠大的流速，從反應器

66、底部向上通過固定化酶柱床時，便能使固定化酶顆粒始終處于流化狀態(tài)。其流動方式使反應液的混合程度介于CSTR的全混型和PBR的平推流型之間。FBR可用于處理黏度較大和含有固體顆粒的底物溶度，同時，亦可用于需要供氣體或排放氣體的酶反應（即固、液、氣三相反應）。因FBR混合均勻，故不適用于有產(chǎn)物抑制的酶反應。,109,(5)鼓泡式反應器,鼓泡式反應器(bubble column reactor, BCR)是利用從反應器底部通入的氣體產(chǎn)生的大

67、量氣泡，在上升過程中起到提供反應底物和混合兩種作用的一類反應器。也是一種無攪拌裝置的反應器。鼓泡式反應器可以用于游離酶和固定化酶的催化反應。在使用鼓泡式反應器進行固定化酶的催化反應時，反應系統(tǒng)中存在固、液、氣三相，又稱為三相流化床式反應器。鼓泡式反應器的結構簡單，操作容易, 剪切力小，物質(zhì)與熱量的傳遞效率高，是有氣體參與的酶催化反應中常用的一種反應器。例如氧化酶催化反應需要供給氧氣，羧化酶的催化反應需要供給二氧化碳等。,110,

68、(6)膜反應器,膜反應器（membrane reactor, MR）是將酶催化反應與半透膜的分離作用組合在一起而成的反應器?？梢杂糜谟坞x酶的催化反應，也可以用于固定化酶的催化反應。用于固定化酶催化反應的膜反應器是將酶固定在具有一定孔徑的多孔薄膜中，而制成的一種生物反應器。膜反應器可以制成平板型、螺旋型、管型、中空纖維型、轉(zhuǎn)盤型等多種形狀。常用的是中空纖維反應器。,111,簡稱CSTR-UFR。在CSTR（連續(xù)式攪拌罐）出口處設置一個