食品微生物檢驗方法

1、食品微生物檢驗方法,內(nèi)容提要,菌落總數(shù)檢測大腸菌群及大腸桿菌檢測金黃色葡萄球菌檢測沙門氏菌檢測單核細胞增生李斯特氏菌檢測,菌落總數(shù)測定——菌落總數(shù)的概念,菌落總數(shù)是指在被檢樣品的單位重量（g）、容積（ml）或表面積（cm2）內(nèi)，所含能于某種固體培養(yǎng)基上，在一定條件下培養(yǎng)后所生成的菌落的總數(shù)。,菌落總數(shù)測定——衛(wèi)生學意義,判定食品被細菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量。及時反映食品加工過程是否符合 衛(wèi)生要求，為被檢食品衛(wèi)生學評

2、價提供依據(jù)。通常認為，食品中細菌數(shù)量越多， 則可考慮致病菌污染的可能性越 大，菌落總數(shù)的多少在一定程度 上標志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣。,,,,,,FDA BAM 菌落總數(shù)測定流程,檢樣xg/mL+9xml稀釋液（磷酸鹽緩沖液） 適當十倍稀釋樣品選擇2~3個連續(xù)適宜稀釋度各取1mL分別加入滅菌平皿內(nèi)（每個稀釋度做兩個

3、平行） 每皿內(nèi)加入適量平板計數(shù)瓊脂（PCA） 35 ℃ ，48 ± 2h菌落計數(shù),,,,,FDA BAM 菌落計數(shù)方法,選擇25~250CFU之間的菌落進行計數(shù)，計算公式如下： N=∑C/（1*n1+0.1*n2）*d所有平板的菌落數(shù)都不足25C

4、FU，報告EAPC/ml（g）為＜25*1/d。 EAPC：estimated aerobic plate count所有平板的菌落數(shù)都超過250CFU，但不足100/cm2 ，報告EAPC/ml（g）為最接近250CFU的平板菌落數(shù)的估計值，乘以相應(yīng)的稀釋度。所有平板的菌落數(shù)都超過100/cm2 ，計算平板的面積（直徑為90mm的平板面積為65cm2），估計最高稀釋度每cm2的菌落數(shù)，乘以相應(yīng)平板面積作為該稀釋度的菌落計

5、數(shù)結(jié)果，報告EAPC/ml（g）為＞65*100* 1/d。無法計數(shù)的平板報告LA（Laboratory Accident）。最終結(jié)果保留前兩位有效數(shù)字。按照4舍6入，5是奇進偶不進。,ISO4833-2003 菌落總數(shù)測定流程,檢樣xg/mL+9xml稀釋液（磷酸鹽緩沖液） 適當十倍稀釋樣品選擇2~3個連續(xù)適宜稀

6、釋度各取1mL分別加入滅菌平皿內(nèi)（每個稀釋度做兩個平行） 每皿內(nèi)加入適量（12~15mL）平板計數(shù)瓊脂（PCA）， 30±1 ℃ ，72 ±3 h菌落計數(shù),,,,,如果懷疑樣品中含有在培養(yǎng)基表面蔓延生長的菌落，待瓊脂凝固后，在其上覆蓋一層（

7、4mL）水瓊脂。,,平板疊放不超過6個,,ISO4833-2003菌落計數(shù)方法,選擇連續(xù)2個稀釋度不超過300CFU的平板，且一個平板至少含15CFU進行計數(shù)，計算公式如下： N=∑C/（n1+0.1*n2）*d所有平板的菌落數(shù)都不足15CFU，計算2平板菌落的算術(shù)平均值m，液體樣品：NE=m 固體樣品： NE=m×d-1無菌生長：液體樣品：less than 1;

8、 固體樣品：less than 1 ×d-1最終結(jié)果保留前兩位有效數(shù)字。,菌落總數(shù)測定幾點說明,由于檢樣中采用30/35℃有氧條件下培養(yǎng)，因而并不是樣品中實際的總活菌數(shù)，一些特殊營養(yǎng)要求的細菌、厭氧菌、微需氧菌、以及非嗜中溫細菌，均難以反映出來。鑒于食品檢樣中的細菌細胞是以單個、成雙、鏈狀、葡萄狀或成堆的形式存在，因而在平板上出現(xiàn)的菌落可以來源于細胞塊，也可以來源于單個細胞，因而平板上所得菌落的數(shù)字不應(yīng)報告活菌數(shù)，而

9、應(yīng)以單位重量、容積或表面積內(nèi)的菌落數(shù)或菌落形成單位（colony forming units，CFU）報告。,菌落總數(shù)測定幾點要求,每個樣品從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用的時間不得超過15min，主要為防止細菌增殖和產(chǎn)生片狀菌落。樣液與瓊脂應(yīng)充分混合，避免將混合物濺到平皿壁和皿蓋上。皿內(nèi)瓊脂凝固后，不要長時間放置，然后倒置培養(yǎng)，可避免菌落蔓延生長。檢樣過程中應(yīng)用稀釋劑做空白對照，用以判定稀釋液、培養(yǎng)基、平皿或吸管可能存在的污染。同時

10、，檢樣過程中應(yīng)在工作臺上打開一塊空白平板計數(shù)瓊脂，其暴露時間應(yīng)與檢樣時間相當，以了解檢樣在檢驗操作過程中有無受到來自空氣的污染。檢樣稀釋液有時帶有食品顆粒，為避免與細菌菌落發(fā)生混淆，可作一檢樣稀釋液與平板計數(shù)瓊脂混合的平皿，不經(jīng)培養(yǎng)，于4 ℃放置，以便在計數(shù)檢樣時用作對照。,大腸菌群的定義,大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。大腸菌群不是細菌學上的分類命名，而是根據(jù)衛(wèi)生學方面的要求，提出的與糞

11、便污染有關(guān)的細菌，即作為食品、水體等是否受過人畜糞便污染的指示菌，這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致。根據(jù)進一步的生化試驗，可將這群細菌再分為大腸艾希氏菌（俗稱大腸桿菌）、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。,,大腸桿菌的定義,大腸桿菌（也稱大腸埃希氏菌），分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。大腸桿菌指革蘭氏陰性無芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣、IMViC試驗（靛基質(zhì)、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗）為++--或-+--的細菌。

12、與人類有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌，包括五種：腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、致病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、黏附性大腸桿菌（EAEC）。,大腸菌群和大腸桿菌的關(guān)系,耐熱大腸菌群的定義：能在液體乳糖培養(yǎng)基中35/37 ℃ 培養(yǎng)48h產(chǎn)酸產(chǎn)氣，并在44.5℃培養(yǎng)24h產(chǎn)酸產(chǎn)氣的細菌（依據(jù)ISO標準）,衛(wèi)生學意義,大腸菌群和大腸桿菌是評價衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標，作為食品中的糞便污染指標。

13、食品中檢出大腸菌群，表明該食品有糞便污染，既可能有腸道致病菌存在，因而也就有可能通過污染的食品引起腸道傳染病的流行。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。大腸桿菌在外界存活時間與一些主要腸道致病菌接近，它的出現(xiàn)預(yù)示著某些腸道病原菌的存在，因此該菌是國際上公認的衛(wèi)生監(jiān)測指示菌。近年來，有些國家在執(zhí)行HACCP管理中，將大腸桿菌檢測作為微生物污染狀況的監(jiān)測指標和HACCP實施效果的評估指標。,大腸桿菌的生

14、物學特性,基本形態(tài)： 此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm，多單獨存在或成雙，但不呈長鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過10根，故菌體動力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。,大腸桿菌的生物學特性,培養(yǎng)特性：大腸桿菌合成代謝能力強，在含無機鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。最適生長溫度為37℃，在42

15、-44 ℃條件下仍能生長，生長溫度范圍15-46 ℃。,在普通營養(yǎng)瓊脂上有3中菌落形態(tài)： 1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、 光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易 在生理鹽水中自凝； 3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。,大腸菌群及大腸桿菌測定 ——MPN法檢驗流程（FDA

16、BAM）,檢樣50g+450ml稀釋液 適當十倍稀釋樣品選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個稀釋度接種三管LST肉湯（每管9mlLST肉湯并加有導(dǎo)管），每管接種1mL 35℃ ，24 ± 2h ~48 ± 2h

17、 沒有產(chǎn)氣管 有產(chǎn)氣管 報告陰性 接種BGLB肉湯管 接種EC肉湯

18、 35 ± ℃ ，48 ± 2h 44.5±0.5 ℃ （水浴培養(yǎng)）

19、 24 ± 2h ~48 ± 2h 查MPN表報告結(jié)果 產(chǎn)氣管接種EMB平板（35℃、18~24h） （大腸菌群） 從EMB平板上挑取5個可疑菌轉(zhuǎn)接到P

20、CA斜 面，進行革蘭氏染色、IMVC生化鑒定、接

21、 種LST復(fù)檢產(chǎn)氣 查MPN表報告結(jié)果（大腸桿菌）,,,,,,,,,,,,,,大腸菌群測定——MPN法檢驗幾點說明,MPN檢索表： MPN 為最大可能數(shù)(Most Probable Number)的簡稱。這種方法，對樣品進行連續(xù)系列稀釋，加入培養(yǎng)基進

22、行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。MPN檢索表只給了三個稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。初發(fā)酵和證實試驗： 1）兩步法進行了兩次乳糖發(fā)酵試驗。初發(fā)酵和證實實驗所用培養(yǎng)基不同，但都是為了證實培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。 LST中提供了磷酸鹽緩沖體系，氯化鈉可維持滲透壓，月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群的生長，這個緩沖蛋白胨乳糖

23、肉湯允許“緩慢乳糖發(fā)酵（Slow lactose fermentations）”來促進菌體產(chǎn)氣。BGLB中膽鹽和煌綠可以抑制革蘭氏陽性細菌和除了大腸菌群的很多革蘭氏陰性細菌。 2）初發(fā)酵陽性管，不能肯定就是大腸菌群細菌，經(jīng)過證實試驗后，有時可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗步驟的符合率，初發(fā)酵與證實試驗相差較大。因此，在實際檢測工作中，證實試驗是必需的。產(chǎn)氣量與倒管： 在乳糖發(fā)酵試驗工作中，經(jīng)常可以看到在發(fā)酵

24、倒管內(nèi)極微少的氣泡（有時比小米粒還?。袝r可以遇到在初發(fā)酵時產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實驗表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進一步試驗。,大腸桿菌測定——EMB選擇性分離鑒別,EMB平板典型大腸桿菌菌落特征：中心黑色或紫紅色，有或無綠色金屬光澤,大腸桿菌測定—

25、—EMB選擇性分離鑒別,EMB是一種弱選擇性培養(yǎng)基，一些球菌也可在該培養(yǎng)基上生長；高壓滅菌可使得美藍還原從而使培養(yǎng)基的顏色呈不均一橘黃色，輕輕搖動培養(yǎng)基可以恢復(fù)原有的正常紫色，傾注平板前應(yīng)先搖勻；大腸桿菌在該培養(yǎng)基上并不一定總是呈現(xiàn)綠色的金屬光澤；該培養(yǎng)基受可見光易使其中的成分氧化，儲存及培養(yǎng)細菌時都應(yīng)在避光條件。,大腸桿菌測定——革蘭氏染色,基本原理： 革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種重要的鑒別染色法。

26、1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。此法可將細菌分為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌兩大類。 革蘭氏染色的機理主要是利用兩類細菌的細胞壁成分和結(jié)構(gòu)的不同。革蘭氏陰性菌的細胞壁中含有較多的類脂質(zhì)，而肽聚糖的含量較少。當用酒精或丙酮酸脫色時，類脂質(zhì)被溶解，增加了細胞壁的通透性，使初染后的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細胞被脫色，經(jīng)復(fù)染后，又染上復(fù)染液的顏色。而革蘭氏陽性菌細胞壁中肽聚糖的含量多而且交聯(lián)度大，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)乙

27、醇或丙酮洗脫后，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，因此細胞仍保留初染時的顏色。,大腸桿菌測定——革蘭氏染色,Gram negative,Gram positive,Gram straining,大腸桿菌測定——革蘭氏染色,基本步驟：將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染1min，水洗；滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脫色約15～30s,直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗；滴加番紅復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗、待干

28、、鏡檢。結(jié)果：革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。,,,大腸桿菌測定——生化鑒定,I M Vi C生化試驗,金黃色葡萄球菌——概述,根據(jù)《伯杰氏鑒定細菌學手冊》，按葡萄球菌的生理化學組成，將葡萄球菌分為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)和腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)，其中金葡多為致病性菌，表葡偶爾致病。金黃色葡萄球菌是人類化膿性感染中最常

29、見的病原菌?？梢鹁植炕撔愿腥?，如癤、癰、皮下膿腫、外科切口及燒傷創(chuàng)面的感染；也可引起肺炎、偽膜性腸炎、腎盂腎炎、心包炎等多系統(tǒng)的化膿性感染；還可引起敗血癥、膿毒癥等全身性感染。葡萄球菌的致病力強弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶。,金黃色葡萄球菌——生物學特性,金黃色葡萄球菌呈球形，直徑0.8μm左右，排列成葡萄串狀 ，無芽孢，無莢膜。,革蘭氏染色陽性，但衰老、死亡或被白細胞吞噬的菌體，常呈革蘭氏陰性。,金黃色葡萄球菌——生

30、長特性,金黃色葡萄球菌在肉湯中呈渾濁生長，在胰酪胨大豆肉湯內(nèi)有時液體澄清，菌量多時呈渾濁生長。,血平板上金黃色葡萄球菌呈金黃色，有時也為白色，大而突起、圓形、不透明、表面光滑，周圍有溶血圈。,Baird-Parker平板上金黃色葡萄球菌圓形突起、光滑、濕潤，顏色呈灰色到黑色，邊緣淡色，周圍為一渾濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度。,金黃色葡萄球菌檢驗——方法適用性,MPN法：適用于檢測帶有大量競爭菌的食品及其原

31、料和未經(jīng)處理的含少量金黃色葡萄球菌的食品。直接平板計數(shù)法：適用于檢查金黃色葡萄球菌數(shù)不小于10/g（ml）的食品。增菌培養(yǎng)法：適用于檢查含有受損傷的金黃色葡萄球菌的加工食品。,,,定量方法,定性方法,金黃色葡萄球菌檢驗——直接平板計數(shù)法,檢樣（50g+450mL稀釋液） 適當十倍稀釋樣品 選擇2~3個連續(xù)適宜稀釋度

32、 吸取1ml菌液按照0.3mL、0.3mL、0.4mL分別涂布于 3塊90mmBaird-Parker平板上（做平行試驗） 35℃ ，45~48 h

33、 確證試驗 報告,,,,,,或涂布于1塊140mm平板上,,FDA BAM 金黃色葡萄球菌檢驗——MPN法,檢樣（50g+450mL稀釋液） 適當十倍稀釋樣品 選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個稀釋度接種三管10% Na

34、Cl TSB肉湯，每管接種1mL 35℃ ，48 ±2 h 從生長的管中接種1環(huán)劃線于 Baird-Parker平板上 35℃ ，48 h

35、 確證試驗 報告,,,,,,含1%丙酮酸鈉,FDA BAM 金黃色葡萄球菌確證試驗,1.凝固酶試驗方法：從平板上至少挑取1個可疑金黃色葡萄球菌菌落，移種到TSB/BHI肉湯中，置35℃培養(yǎng)18-24h。取肉湯培養(yǎng)物0.3mL同0.5mL凝固酶試驗兔血漿充分混合，置35℃培養(yǎng)，定時觀察是否有凝塊形成，至少觀

36、察6h。 試驗中需同時做已知陽性和陰性對照。結(jié)果判定：以內(nèi)容物完全凝固，使試管倒置或傾斜時不流動為陽性。部分凝固（2+和3+）的必須進行生化鑒定加以證實。,,FDA BAM金黃色葡萄球菌確證試驗,2.革蘭氏染色對所有的可疑培養(yǎng)物都要進行革蘭氏染色。3.生化鑒定過氧化氫酶試驗葡萄糖厭氧利用試驗甘露醇厭氧利用試驗金葡溶菌酶敏感性試驗?zāi)蜔岷怂崦冈囼灒ㄝo助）,Staphylococcus aureus on DNase Ag

37、ar,FDA BAM 2種葡萄球菌和微球菌的典型特性,ISO 金黃色葡萄球菌檢驗——MPN法,檢樣（xg+9xmL稀釋液） 適當十倍稀釋樣品 選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個稀釋度接種三管modified Giolitti and Cantoni broth，

38、 37℃ ，24~48 h 從變黑或出現(xiàn)黑色沉淀的管中 接種1環(huán)培養(yǎng)物于 Baird-Parker平板上 37℃ ，48 h

39、 確證試驗 報告,,,,,,接種10mL 于10mL雙料肉湯，接種1mL 于9mL單料肉湯。,,小心的于接種管中培養(yǎng)基頂部傾注一定量的水瓊脂，使其凝固形成密封塞。,,ISO 金黃色葡萄球菌確證試驗,凝固酶試驗結(jié)果判定： - 1+ 2+

40、 3+ 4+,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,negative positive,,沙門氏菌屬簡介,1880年E. Berth首先發(fā)現(xiàn)傷寒沙門氏菌，1885年Salmon與Smith又分離出豬霍亂沙門氏菌，以后取Salmon氏之名為本菌屬之名。沙門氏菌屬是一群符合腸桿菌科定義并與其血清學相

41、關(guān)的革蘭氏陰性、需氧性、無芽孢桿菌。本菌屬種類繁多，抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)2000多個血清型，我國已發(fā)現(xiàn)血清型近200個。,沙門氏菌屬——生物學特性,形態(tài)特征： 革蘭氏陰性，大小為1~3×0.4~0.9μm的兩端鈍圓的短桿菌，無芽孢，一般無莢膜，除雞沙門氏菌和雛沙門氏菌以外，都有周身鞭毛，運動力強。,培養(yǎng)特性：沙門氏菌需氧或兼性厭氧，10-42 ℃都可生長，最適生長溫度為37℃，最適pH為6.8~7.8。營養(yǎng)瓊脂

42、平板上：35~37℃培養(yǎng)18~24h，其菌落大小一般為2~3mm，光滑、濕潤、無色、半透明、邊緣整齊。血平板上：中等大小的灰白色菌落。,生化特性：絕大多數(shù)沙門氏菌有規(guī)律的發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，但也有不產(chǎn)氣者，不發(fā)酵蔗糖和側(cè)金盞花醇、不產(chǎn)生吲哚、不分解尿素。,,沙門氏菌屬——生物學特性,沙門氏菌屬的抗原,菌體抗原（O抗原）表面抗原（K抗原）：Vi抗原和M抗原鞭毛抗原（H抗原）纖毛抗原,FDA BAM沙門氏菌檢驗流程,前增菌

43、 25g樣+225mL乳糖肉湯 （肉制品、肉副產(chǎn)品、動物產(chǎn)品） 勻質(zhì)2min，室溫放置60 ±5min 混合均勻，測定調(diào)節(jié)PH6.

44、8 ±0.2 35℃、24 ± 2h選擇性增菌 0.1ml+10mlMM（RV） 1ml+10mlTTB

45、 42℃、24h （水浴培養(yǎng)） 35℃、24h 43℃、24h（水浴培養(yǎng)） 含菌量高

46、 含菌量低分離培養(yǎng) 劃線接種 選擇性培養(yǎng)基（BS、XLD、HE） 35℃、24~48h（BS）生化鑒定 每個平板挑取至少2個可疑菌（包括典型和非典型各2個）

47、 接種TSI三糖鐵、LIA賴氨酸鐵高層斜面（LIA高層深4cm） （松蓋以保持有氧條件防止產(chǎn)生過多H2S） 35℃、24±2h

48、 棄去 尿素酶試驗 衛(wèi)矛醇、 氰化鉀、丙二酸鈉、吲哚試驗 陽性 陰性血清學

49、 血清學試驗——沙門氏菌的分類 報告結(jié)果,,,,,,,,,,,,,,生鮮食物、嚴重污染的食品和動物飼料,,,,,ISO6579沙門氏菌檢驗流程,前增菌 25g樣+225mLBPW

50、 勻質(zhì) 37±1℃、18 ± 2h選擇性增菌 0.1ml+10mlRVS

51、 1ml+10mlMKTTn 41.5 ± 1℃、24 ± 3h 37 ± 1℃、24 ± 3h （水浴培養(yǎng)）分離培養(yǎng) 劃線接種選擇性培養(yǎng)基（XLD

52、和第二種選擇性培養(yǎng)基，如 BS） 37℃、24~48h（BS） 每個平板挑取至少5個可疑菌進行純培養(yǎng)和確認試驗

53、 37℃、24±3h 生化鑒定 TSI、尿素酶、賴氨酸脫羧酶、β-牛乳糖、V-P、 吲哚試驗血清學 血清學試驗——沙門氏菌的分類

54、 報告結(jié)果,,,,,,,,,,,,,,ISO6579沙門氏菌生化試驗表,沙門氏菌檢驗選擇性分離培養(yǎng),XLD瓊脂：FDA BAM——典型菌落：粉色菌落，帶或不帶黑色中心。許多沙門氏菌培養(yǎng)物可呈 現(xiàn)大的具光澤的黑色中心或幾乎為全部黑色的菌落。

55、 ——非典型菌落：黃色帶或不帶黑色中心。ISO——中心黑色、周圍由于指示劑顏色的改變而出現(xiàn)紅色的輕微透明帶。,沙門氏菌檢驗選擇性分離培養(yǎng),BS瓊脂：FDA BAM——典型菌落：產(chǎn)硫化氫菌落黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周 圍的培養(yǎng)基通常開始呈褐色，但伴隨培養(yǎng)時間的延長而

56、 變?yōu)楹谏⒂袝灜h(huán)效應(yīng)； ——非典型菌落：有些菌株不產(chǎn)生硫化氫，形成灰綠色菌落，周圍培養(yǎng) 基不變色。,50071 44104,Blank 50115,沙門氏菌檢驗選擇性分離培養(yǎng),HE瓊脂：FDA BAM——典型菌落：蘭綠色至蘭色，多數(shù)菌株產(chǎn)硫化氫，菌落帶或不帶

57、黑色 中心或幾乎全黑色。 ——非典型菌落：乳糖陽性的菌株為黃色中心黑色或全黑色。,沙門氏菌檢驗生化鑒定,TSI：典型反應(yīng)：斜面產(chǎn)堿（K）：紅色； 底部產(chǎn)酸（A）：黃色； 產(chǎn)H2S：黑色（少數(shù)不產(chǎn)）,沙門氏菌檢驗——幾點注意,冷凍樣品解

58、凍需在45℃以下，有自動調(diào)溫器自控的水浴鍋內(nèi)不斷攪拌進行15min或在2-8℃，18小時內(nèi)軟化。為保證檢驗的準確性，必須在選擇性培養(yǎng)基上挑取足夠數(shù)量的菌落進行生化和血清學鑒定。進行生化反應(yīng)時，應(yīng)以純培養(yǎng)物進行試驗，如出現(xiàn)血清學陽性，而生化反應(yīng)特征不符合時，應(yīng)對接種物進行純化，用純化后的培養(yǎng)物重新進行生化試驗。測試中應(yīng)同時接種陽性對照菌株。,李斯特菌屬簡介,《伯杰氏鑒定細菌學手冊》第9版中，李斯特菌屬有7個種：單核細胞增生李斯特氏菌

59、（L. monocytogenes）、英諾克李斯特氏菌（L. innocua） 、西爾李斯特氏菌（L. seeligeri） 、威爾斯李斯特氏菌（L. welshimeri） 、綿羊李斯特氏菌（L. ivanovvi） 、格氏李斯特氏菌（L. grayi） 、默氏李斯特氏菌（L. murrayi） 。單核細胞增生李斯特氏菌是李斯特氏菌病的致病菌，可引起動物的感染，也可引起人的感染。,單核細胞增生李斯特氏菌——生物學特性,形態(tài)特征：

60、 革蘭氏陽性短桿菌，大小為0.4~0.5×0.5~2μm， 兩端鈍圓，常兩兩相串成彎曲及V形，偶爾有球狀、雙球狀、短鏈狀，但很少有長鏈狀，兼性厭氧、無芽孢，一般不形成莢膜。該菌有4根周毛和1根端毛，周毛易脫落。20℃培養(yǎng)后可見到很多鞭毛。,培養(yǎng)特性：生長溫度為2~42℃（冷藏不能阻止該菌的生長），最適生長溫度為35~37℃。20~25 ℃培養(yǎng)有動力，37 ℃培養(yǎng)動力消失；在顯微鏡下觀察該菌新鮮的室溫肉湯培養(yǎng)物可見翻筋

61、斗運動。在pH3.8~4.4仍能生長，在pH中性至弱堿性（9.6）、氧分壓略低、二氧化碳張力略高的條件下該菌生長良好， 在6.5%NaCl肉湯中也能良好生長。血平板上：菌落通常不大呈灰白色， 刺種血平板可產(chǎn)生窄小的β溶血環(huán)。,,單核細胞增生李斯特氏菌——生物學特性,FDA BAM單核細胞增生李斯特氏菌檢驗流程,檢樣25g增菌

62、 EB增菌液基礎(chǔ)225mL 30℃ 4h 加入抑菌劑

63、 30℃ 20h 30℃ 44h 選擇性分離培養(yǎng) 接種OXA和 PALCAM 接種OXA和 PALCAM

64、 35℃ 24-48h 35℃ 24-48h 生化鑒定 TSA-YE純培養(yǎng)

65、 30℃ 24-48h 典型運動 TSB-YE 過氧化氫酶試驗 革蘭氏染色

66、 溶血試驗,,,,,,,,,,,麥芽糖,葡萄糖,硝酸鹽還原試驗,甘露醇,七葉苷,鼠李糖,木糖,SIM動力,,,,,,培養(yǎng)24h,培養(yǎng)48h,,ISO單核細胞增生李斯特氏菌檢驗流程,測試樣品（x g或x mL）+9x mL一次增菌培養(yǎng)基（Half Fraser肉湯） 

67、 30℃培養(yǎng)24±2h1mL培養(yǎng)液加入 劃線接種Oxford瓊脂 10mL二次增菌培養(yǎng)基中 和PALCAM瓊脂 （Fraser肉湯）

68、35℃或37℃培養(yǎng)48±2h 30℃、35℃或 劃線接種Oxford瓊脂 37℃培養(yǎng)24-48h 和PALCAM瓊脂

69、 30℃、35℃或37℃培養(yǎng)24-48h  李斯特菌屬的確證： -          挑取可疑菌接種TSAYE培養(yǎng)基

70、 -          過氧化氫酶試驗 -        

71、60; 革蘭氏染色 -          動力試驗  單核細胞增生李斯特菌的確證：

72、 -          溶血試驗 -          碳源利用試驗