食品中各類微生物檢驗

1、食品中各類微生物檢驗,第一節(jié) 食品中菌落總數(shù)的測定第二節(jié) 食品中大腸菌群的測定第三節(jié) 食品中金黃色葡萄球菌的檢驗第四節(jié) 食品中沙門氏菌的檢驗第五節(jié) 食品中志賀氏菌的檢驗,第六節(jié) 食品中溶血性鏈球菌的檢驗第七節(jié) 食品中病原性大腸艾希氏菌的檢驗第八節(jié) 食品中變形桿菌的檢驗第九節(jié) 食品中空腸彎曲菌的檢驗第十節(jié) 食品中致病性弧菌檢驗,第十一節(jié) 食品中耶爾森氏菌的檢驗第十三節(jié) 食品中肉毒梭菌的檢驗第十四

2、節(jié) 食品中蠟樣芽胞桿菌的檢驗第十五節(jié) 食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢驗第十六節(jié) 食品中霉菌和酵母菌的檢驗,第一節(jié) 食品中菌落總數(shù)的測定,食品中細(xì)菌數(shù)量越多，則食品腐敗變質(zhì)的速度就越快，甚至可引起食用者的不良反應(yīng)。如有人認(rèn)為細(xì)菌數(shù)量達(dá)到100~1000萬個／g時，食品就可能引起食用者的食物中毒。食品中細(xì)菌數(shù)量越少，食品存放的時間越長。如：,0℃時菌落數(shù)為105cfu/cm2的牛肉，可存放7d；菌落數(shù)為102cfu/cm2時， 可存放

3、18d。0℃時菌落數(shù)為105cfu/cm2的魚可存放6d，菌落數(shù)為103cfu/cm2時， 可存放12d。,菌落(colony)：生長在固體培養(yǎng)基上，來源于一個細(xì)胞，肉眼可見的細(xì)胞群體。,菌落總數(shù)(total colony number)：通過平板菌落計數(shù)的方法，對被檢樣品單位重量、容積、面積的活菌在普通營養(yǎng)瓊脂平板上形成的菌落進行計數(shù)，所得到的所有嗜中溫的、需氧和兼性厭氧的細(xì)菌菌落總數(shù)。是活的細(xì)胞總數(shù)。,按國家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定，即在需氧

4、情況下，37℃培養(yǎng)48h，能在普通營養(yǎng)瓊脂平板上生長的細(xì)菌菌落總數(shù).所以厭氧或微需氧菌、有特殊營養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細(xì)菌，由于現(xiàn)有條件不能滿足其生理需求，故難以繁殖生長。因此,菌落總數(shù)并不表示實際中的所有細(xì)菌總數(shù)，菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細(xì)菌的種類，所以有時被稱為雜菌數(shù)，需氧菌數(shù)等。,檢驗方法,基本操作一般包括 :樣品的稀釋－－傾注平皿－－培養(yǎng)48小時－－計數(shù)報告。以無菌操作取檢樣25g（或25mL)，放于225mL滅菌生理鹽水玻璃瓶

5、內(nèi)（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠) 制成1：10的均勻稀釋液。 用1mL滅菌吸管吸取1：10稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混合均勻，制成1：100的稀釋液,另取1mL滅菌吸管，按上項操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支1mL滅菌吸管。 傾注培養(yǎng) 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)ξ廴厩闆r的估計，選擇2~3個適宜稀釋度，分別在制10倍遞增稀釋的同時，以吸取該稀釋度的吸管移取1mL稀釋

6、液于滅菌平皿中，每個稀釋度做兩個平皿。將涼至46℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15mL，并轉(zhuǎn)動平皿，混合均勻。同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1mL稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內(nèi)作空白對照。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h，取出計算平板內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數(shù)。,計數(shù)和報告 選取菌落數(shù)在30~300之間的平板作為菌落總數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)。我國飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)：

7、 ≤ 100個細(xì)菌總數(shù)/1mL飲水,第二節(jié) 食品中大腸菌群的測定,一、大腸菌群與食品衛(wèi)生質(zhì)量大腸菌群系指一群在37℃能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性的無芽胞桿菌。從種類上講，大腸菌群包括許多生化及血清學(xué)特性均很不相同的細(xì)菌，其中有埃希氏菌屬，枸椽酸菌屬、腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬等等。以埃希氏菌屬為主。大腸菌群MPN是指在100mL(或100g)食品檢樣中所含的大腸菌群的最近似或最可能數(shù)。,大腸桿菌,(埃希氏菌屬

8、 Escherichine),,是人類和動物腸道中的正常菌群,出生后數(shù)小時就進入腸道，并終生伴隨,以大腸埃希氏菌（E.coli）最為重要,,,,在環(huán)境和食品衛(wèi)生學(xué)上，常被用作糞便污染的檢測指標(biāo)；作為腸道病原菌污染食品的指示菌。當(dāng)然食品中檢驗出大腸菌群，只能說明有腸道病原菌存在的可能，兩者并非一定平行存在。但只要食品中檢出大腸菌群，則說明有糞便污染。該食品仍可被認(rèn)為是不衛(wèi)生的。,衛(wèi)生學(xué)指標(biāo),在分子生物學(xué)和基因工程實驗中,重

9、要的實驗材料和研究對象,大腸桿菌也是重要的實驗材料和研究對象,正常菌群，一般不致病,1、條件致病,某些帶有致病基因的血清型，引起腸道感染,兩大原因可以致病,細(xì)菌居住部位改變引起的腸外感染；,尿路感染最常見,2、致病菌株,日本再度發(fā)生O157病菌感染事件 --------------------------------------------------------　　新華網(wǎng)東京４月６日專電日本最近再度發(fā)生病原性大腸桿菌Ｏ１５７集體

10、感染事件，到５日為止，東京、千葉、埼玉、神奈川、茨木、群馬等地已有１２５人受到感染。 　　這次集體感染于３月１２日首先在千葉縣柏市被發(fā)現(xiàn)。診斷和調(diào)查結(jié)果表明，患者是由于食用了一些工廠生產(chǎn)的不潔凈的食品而被感染的。 　　日本曾于５、６年前首次發(fā)生病原性大腸桿菌Ｏ１５７集體感染事件?；颊哂邪l(fā)燒、惡心、嘔吐等癥狀。,2001年4月9日17:29　新華網(wǎng)報道,2001年，江蘇、安徽等地，腸出血性大腸桿菌O157:H7，造成177人死亡，

11、中毒人數(shù)超過2萬人。,大腸菌群MPN的常規(guī)檢驗方法是將不同倍數(shù)的檢樣稀釋液接種到乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，經(jīng)一定的溫度、時間發(fā)酵，若均不產(chǎn)氣者則可報告為陰性；如有產(chǎn)氣者，則需進行分離培養(yǎng)，證實試驗，然后查取MPN檢索表，報告出每100mL(g)大腸菌群的最近似數(shù)。大腸菌群MPN的檢驗程序如下：,,檢樣稀釋：,(1)以無菌操作將檢樣25mL(或25g)放于含有225mL滅菌生理鹽水或其它稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi)

12、，經(jīng)充分振搖或研磨作成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用勻質(zhì)器。以8000-10000轉(zhuǎn)／分鐘的速度處理1分鐘，做成 1：10的均勻稀釋液。(2)用1mL滅菌吸管吸取1：10稀輕液1mL．注入含有9mL滅菌生理鹽水或其它稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻．作1：10的稀釋液。,操作步驟,(3)另取1mL滅菌吸管，按上項操作依次作10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用 1支1mL滅菌吸管：(4)根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計，

13、選擇三個稀釋度，每個稀釋度接 種3管。,操作步驟,檢驗方法(一)乳糖發(fā)酵試驗,在乳糖發(fā)酵試驗工作中，經(jīng)常可以看到在發(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡（有時比小米粒還?。袝r可以遇到在初發(fā)酵時產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實驗表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進一步試驗。,操作步驟

14、,將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管，每一稀釋度接種3管，置36+1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24+2小時，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管均不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性。如有產(chǎn)氣者，按下列程序進行。,操作步驟,(二)分離培養(yǎng),將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種到伊紅美蘭瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板上，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)18—24小 時，然后取出，觀察菌落形態(tài)，并作革蘭氏染色

15、和證實試驗。,操作步驟,證實試驗,在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1—2個進行革蘭氏染色。同時接種乳糖發(fā)酵 管，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24+2小時，觀察產(chǎn)氣情況，凡乳糖發(fā)酵管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌，即可報告為大腸菌群陽性 。,操作步驟,報告,根據(jù)證實為大腸群陽性的管數(shù)，查MPN的檢索表(見附錄一)，報告每100mL(g)大腸菌群的最近似數(shù)(MPN)。,大腸菌群檢驗中常用的抑菌劑有膽鹽、十二烷基硫酸鈉、洗衣粉、煌綠

16、、龍膽紫、孔雀綠等。抑菌劑的主要作用是抑制其它雜菌，特別是革蘭氏陽性菌的生長。國家標(biāo)準(zhǔn)中乳糖膽鹽發(fā)酵管利用膽鹽作為抑菌劑，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中LST肉湯利用十二烷基硫酸鈉作為抑菌劑，BGLB肉湯利用煌綠和膽鹽作為抑菌劑。抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌，而有利于大腸菌群細(xì)菌的生長和挑選，但對大腸菌群中的某些菌株有時也產(chǎn)生一些抑制作用。,大腸菌群MPN的其它檢驗方法,大腸菌群MPN的其他測定方法有琉水網(wǎng)膜法、TTC（2、3、5、—氯化三苯四氮唑）顯

17、色法，DC(去氧膽酸鈉)半固體法、紙片法等。,我國飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)：≤ 3個大腸菌群/1L飲水,北美國家一般使用“糞大腸菌群”概念，如AOAC、FDA。SN中的“糞大腸菌群”概念為等同采用AOAC方法，故而使用糞大腸菌群概念；而歐洲使用“耐熱大腸菌群”概念，較少使用“糞大腸菌群”。,項目 依據(jù)耐熱大腸菌群 NMKL、ISO糞大腸菌群 NMKL

18、 AOAC,定義在44.5℃培養(yǎng)，24h內(nèi)能產(chǎn)酸產(chǎn)氣的細(xì)菌在胰蛋白胨肉湯中于44.5℃，24h內(nèi)產(chǎn)生吲哚的耐熱大腸菌群于LST中36℃培養(yǎng)48h內(nèi)產(chǎn)氣，并于EC內(nèi)培養(yǎng)44℃24h產(chǎn)氣的一群細(xì)菌,,,,第三節(jié) 食品中金黃色葡萄球菌的檢驗,金黃色葡萄球菌,急性化膿性感染,食物中毒,正常人帶菌，30

19、-80%,通過工人手和呼吸道污染食品,金黃色葡萄球菌在生牛奶、熟肉制品及冰激凌等3類食品中的檢出率為19.67%；前兩種食品的污染率分別為25.13%和20.33%。,浙江CDC 2000-2004年監(jiān)控結(jié)果,金葡感染,染色觀察,在BP平板上的典型菌落,大阪市政府５日宣布的調(diào)查結(jié)果顯示，因食用日本雪印乳業(yè)公司大阪工廠生產(chǎn)的乳制品而中毒者已逾萬人?！　≡诖筅娓途┒几约案浇犊h，因食用雪印乳業(yè)公司大阪工廠生產(chǎn)的乳制品而中毒發(fā)病者已達(dá)１

20、０６８２人，其中有１５５人被送往醫(yī)院，目前還有３７人在醫(yī)院接受治療?！　?jù)化驗，該工廠生產(chǎn)的一些乳制品中含有黃色葡萄球菌，這種細(xì)菌可產(chǎn)生使人出現(xiàn)腹瀉、嘔吐癥狀的Ａ型腸毒素。該廠乳制品染菌是生產(chǎn)設(shè)備沒有按規(guī)定定期清洗而造成的。,媒體關(guān)于日本雪印牛奶金黃色葡萄球菌中毒事件的報道,日本因食用染菌乳制品中毒者已逾萬人 (2000年7月6日12:39),檢驗方法,樣品處理：無菌取25g或25mL食品樣品，放入225mL滅菌生理鹽水中均質(zhì)，制成

21、1：10稀釋液。增菌培養(yǎng)：將1：10稀釋液接入7.5%NaCl肉湯或胰蛋白胨肉湯中，37°C培養(yǎng)24小時。,分離培養(yǎng)：將上述稀釋液或培養(yǎng)液分別劃線血平板和Baird-Parker平板，置37°C培養(yǎng)24-48小時。金黃色葡萄球菌在血平板上呈金黃或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周圍有溶血圈。在Baird-Parker平板上菌落為圓形，直徑2-3mm，顏色灰或黑色，周圍有一渾濁帶。,,染色觀察：從平板上挑取可疑性菌落進

22、行革蘭氏染色，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性，顯微鏡下呈葡萄狀排列無芽胞、莢膜，直徑0.5-1μm。 血漿凝固酶試驗：吸取0.5mL兔血漿與0.5mL金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯24小時培養(yǎng)物充分混勻，置36±1°C培養(yǎng)，每隔半小時觀察一次，連續(xù)觀察6小時，出現(xiàn)凝固，即將小試管傾斜或倒置時，內(nèi)容物不流動，判為陽性。同時做陰陽性對照。,耐熱核酸酶試驗：將24小時肉湯培養(yǎng)物沸水浴處理15min，用接種環(huán)劃線刺種于甲苯胺蘭-DN

23、A平板，36±1°C培養(yǎng)24小時，在刺種線周圍出現(xiàn)淡粉色者為陽性。,第四節(jié) 食品中沙門氏菌的檢驗,其中許多為人畜共患病,一大群人與動物腸道中的寄生菌,菌群菌型甚多，僅少數(shù)對人致病,,,,沙門氏菌,廣泛存在于動物腸道、內(nèi)臟中。,引起中毒的主要是動物源性食品。,本菌對熱、消毒藥及外界環(huán)境的的抵抗力不強。60℃，20-30min即被殺死。,1、致病物質(zhì)：,致病性與免疫性,侵襲力：,O抗原、 VI抗原,毒

24、素：,內(nèi)毒素,2、所致疾?。?傷寒副傷寒,食物中毒（急性胃腸炎，表現(xiàn)為頭痛、惡心、面色蒼白、出冷汗、隨之出現(xiàn)嘔吐腹瀉、體溫升高，并伴有水樣便，有時帶膿血粘液，重者出現(xiàn)寒戰(zhàn)、抽搐和昏迷等病程3~7d，死亡率0.5%。）,敗血癥,外毒素----腸毒素,傷寒未接受過治療的病人致死率可超過10%，而對經(jīng)過適當(dāng)治療的病人其致死率低于1%，幸存者可變成慢性無癥狀沙門氏菌攜帶者。這些無癥狀攜帶者不顯示發(fā)病癥狀仍能將微生物傳染給其他人(傳統(tǒng)的例

25、子就是瑪麗傷寒)。非傷寒型沙門氏菌敗血癥可由各型沙門氏菌感染所致，能影響所有器官，有時還引起死亡。幸存者可變成慢性無癥狀沙門氏菌攜帶者。,膽囊-----腸道-------糞排菌皮膚----血拴出血--玫瑰疹腎-----尿肝脾-----腫大骨髓------受抑制,傷寒和副傷寒的致病過程,傷寒和副傷寒桿菌,小腸上部粘膜,腸系膜淋巴結(jié),固有層淋巴結(jié),進入血液,再次進入血液,,,,,,,,,第一次菌血癥,第二次菌血癥,病愈后免疫力較牢

26、固，主要是細(xì)胞免疫,3、免疫性,,,,,,沙門氏菌的預(yù)防措施：SSOP、GMP控制個人衛(wèi)生習(xí)慣，嚴(yán)格洗手、消毒以及防止糞便污染水源，加強加工用水的消毒。食用前充分加熱以及防止交叉污染,沙門氏菌在SS平板上,檢驗步驟,1、前增菌：用無選擇性的培養(yǎng)基使處于瀕死狀態(tài)的沙門氏菌恢復(fù)活力。沙門氏菌在食品加工過程中，常常受到損傷而處于瀕死狀態(tài)，因此，對經(jīng)過加工的食品檢驗沙門氏菌時應(yīng)進行前增菌，即用不加任何抑菌劑的培養(yǎng)基BP進行增菌。一般前

27、增菌時間為4h，不宜過長。（為什么？）,2、選擇性增菌,前增菌后或未加工的食品進行選擇性增菌，使沙門氏菌得以增殖，而大多數(shù)其他細(xì)菌受到抑制。直接增菌的食品應(yīng)制成1：1稀釋液，而不能做成1：10稀釋液，因為食品中沙門氏菌數(shù)量較少，1：10降低檢出率，而1：1稀釋液可提高檢出率。增菌液有：SC、TTB、MM。增菌時必須用一個SC和一個TTB或MM。（為什么？）,3、平板分離,分離沙門氏菌的培養(yǎng)基為選擇性鑒別培養(yǎng)基。沙門氏菌主要來源于糞

28、便，而糞便中埃希氏菌屬占絕對優(yōu)勢，所以選擇性增菌后，與沙門氏菌相伴隨的主要是埃希氏菌屬。因此，培養(yǎng)基中加入的指示系統(tǒng)主要是事沙門氏菌和埃希氏菌屬的菌落特征最大限度的分開。常用的分離沙門氏菌的選擇性培養(yǎng)基有：BS、DHL、HE、WS、SS。,4、生化試驗鑒定到屬,初步生化試驗：三糖鐵試驗。測定細(xì)菌對葡萄糖、乳糖、蔗糖的分解、產(chǎn)氣好產(chǎn)硫化氫情況。其他生化試驗：靛基質(zhì)、尿素、氰化鉀、賴氨酸， 4項。若硫化氫+、靛基質(zhì)-、尿素-、氰化鉀-

29、、賴氨酸+，這是典型沙門氏菌的反應(yīng)。5、血清學(xué)分型試驗,沙門氏菌快速檢驗的新方法,免疫熒光抗體法酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）PCR技術(shù),第五節(jié) 食品中志賀氏菌的檢驗,多數(shù)不分解乳糖,志賀氏菌 shigella,是人類細(xì)菌性痢疾最為常見的病原菌，,通稱痢疾桿菌dyseatery bacteria,,革蘭氏陰性菌、無莢膜、無鞭毛，有菌毛,生化反應(yīng),低于其他腸道桿菌，對酸敏感,形態(tài),對理化因素的低抗力,,,,抗原與分類,

30、根據(jù)O抗原分類,,,,分為4群39個血清型（包括亞型）,,致病性,,人類是唯一的患者和帶菌者,,,,,糞—口傳播,,,,感染灶局限于結(jié)腸粘膜層，一般不入血,,,,,,病后免疫期短，也不鞏固,致病性較強，感染10-200個即可發(fā)病。,,致病物質(zhì),1、侵襲力：,菌毛—有利于菌粘附至腸粘膜,2、毒 素：,加重局部和全身癥狀,內(nèi)毒素,,作用于腸壁,,通透性增加,粘膜炎癥、潰瘍,局部,,,全身,,內(nèi)毒素血癥,外毒素（A群1型）,與內(nèi)毒素協(xié)同

31、作用,,,,,,臨床表現(xiàn),急性細(xì)菌性痢疾,急性典型：發(fā)熱、腹痛、膿血粘液便,非急性典型：小兒—中毒型 成人—易誤漏診,慢性細(xì)菌性痢疾：病程遷移二月以上,,,,中毒性痢疾病人,檢驗方法,1、增菌培養(yǎng)：GN增菌液，6~8h。2、選擇性鑒別培養(yǎng)基分離志賀氏菌選擇性瓊脂平板有HE、SS、EMB、麥康凱。這些培養(yǎng)基中都含有乳糖。在這些平板上志賀氏菌的菌落為無色半透明不發(fā)酵乳糖。,3、初步

32、生化試驗、血清學(xué)分型和進一步生化試驗,首先是三糖鐵：斜面產(chǎn)堿（紅色）、底層產(chǎn)酸（黃色）、不產(chǎn)氣硫化氫-、無動力。如出現(xiàn)這樣的結(jié)果，可疑為志賀氏菌，接著做血清學(xué)試驗。,注意,志賀氏菌在常溫存活期較短，因此，當(dāng)樣品采集后，應(yīng)盡快進行檢驗。如果在24h內(nèi)檢驗，樣品可保存在冰箱內(nèi)如果要較長時間保存，必須放在低溫冰箱內(nèi)。,第六節(jié) 食品中溶血性鏈球菌的檢驗,,溶血性鏈球菌在自然界分布較廣，可存在于水、空氣、牛奶、糞便等中。按其在血平板上溶血

33、能力分類，可分為甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、丙型溶血性鏈球菌、亞甲型溶血性鏈球菌。與人類疾病有關(guān)的大多屬于乙型溶血性鏈球菌，?？梢鹌つw和皮下組織的化膿性炎癥及呼吸道感染。還可以通過食品引起猩紅熱、流行性咽炎的爆發(fā)性流行。,培養(yǎng)特性,需氧或兼性厭氧。營養(yǎng)要求較高，普通培養(yǎng)基上生長不良，在加有血液、血清、腹水等的培養(yǎng)基中生長良好，大多數(shù)菌株需蘇氨酸、核黃素、維生素B6、煙酸等生長因子。最適生長溫度37℃，最適pH7.4~7.6

34、。,毒素和酶,致病性鏈球菌可產(chǎn)生多種毒素和酶。溶血素、紅疹毒素、透明質(zhì)酸酶、鏈激酶、殺白細(xì)胞素等。,抵抗力,不強。60℃，30min即被殺死。乙型溶血性鏈球菌對青霉素、紅霉素、氯霉素、四環(huán)素、磺胺都很敏感。青霉素是溶血性鏈球菌感染的首選藥物。,檢驗步驟,樣品處理一般培養(yǎng)分純培養(yǎng)鏈激酶試驗桿菌肽敏感試驗,第七節(jié) 食品中病原性大腸埃希氏菌的檢驗,大腸埃希氏菌，俗稱大腸桿菌，腸桿菌科、埃希氏屬，是指那些能引起人、動物感染及人的

35、食物中毒的一群大腸桿菌。大腸埃希氏菌隨糞便排除后，廣泛分布于自然界，是一種條件致病菌。正常條件下不致病，而且還能合成維生素B和K，生產(chǎn)大腸菌素，對機體有利。,培養(yǎng)特性,需氧或兼性厭氧。最適生長溫度37℃，普通培養(yǎng)基上生長良好。在麥康凱培養(yǎng)基上因發(fā)酵乳糖而產(chǎn)生有色菌落。在EMB上生長成紫黑色有金屬光澤的菌落。,抵抗力,比其他腸道致病菌強。除少數(shù)外，都可被巴氏消毒法所殺滅。在水中可存活數(shù)周至數(shù)月，在冷藏條件下存活更久。對磺胺、鏈霉

36、素、土霉素、金霉素、氯霉素等敏感。而青霉素對它的作用弱，易產(chǎn)生耐藥菌株。,致病性,1、致病因素：侵襲力、內(nèi)毒素、腸毒素。2、所致疾病：腸外感染、腹瀉4種大腸桿菌可引起腹瀉,大腸桿菌O157,侵襲性大腸桿菌（EIEC）,致瀉性大腸埃希氏菌,腸毒素性大腸桿菌（ETEC）,致病性大腸桿菌（EPEC）,出血性大腸桿菌（EHEC）,,,,,,,,,,致病性大腸桿菌引起的腹瀉,檢驗程序,增菌分離生化試驗血清學(xué)試驗?zāi)c毒素試驗,第八節(jié) 食

37、品中變形桿菌的檢驗,變形桿菌屬于腸桿菌科，包括普通變形桿菌、奇異變形桿菌、產(chǎn)粘變形桿菌三種。變形桿菌為腐敗菌，廣泛分布在自然界中，如土壤、水、垃圾、腐敗有機物及人或動物的腸道內(nèi)。,變形桿菌一般不致病，為條件致病菌。可引起多種感染。常見感染有呼吸道感染、腹瀉、尿路感染、腹膜炎、中耳炎、乳突炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎入敗血癥，還可引起食物中毒。,中毒食品主要以動物性食品為主，其次為豆制品和涼拌菜，發(fā)病季節(jié)多在夏、秋，中毒原因為被污染食品在食用

38、前未徹底加熱，其產(chǎn)生的毒素可引起中毒。 變形桿菌食物中毒是我國常見的食物中毒之一。 抵抗力：不耐熱，于60℃，5~30min皆可殺死。變形桿菌屬自然耐藥菌株多，治療時應(yīng)做藥物敏感試驗，一般認(rèn)為卡那霉素為首選藥物，有一定的療效。,檢驗程序,增菌培養(yǎng)分離培養(yǎng)初步鑒定最后鑒定食物中毒檢驗,食物中毒檢驗,發(fā)生食物中毒案件時，除自糞便、嘔吐物、及可疑食物分離細(xì)菌外，還需做以下試驗：測定食物中變形桿菌總數(shù)；菌株的同一性試驗；動物試

39、驗；特異抗體測定。,第九節(jié) 食品中空腸彎曲菌的檢驗,空腸彎曲菌（c.jejuni）菌體輕度彎曲似逗點狀，菌體一端或兩端有鞭毛，運動活潑，在暗視野鏡下觀察似飛蠅。有莢膜，不形成芽胞。微需氧菌，最適溫度為37～42℃。在正常大氣或無氧環(huán)境中均不能生長。已被認(rèn)為是引起急性腹瀉的重要原因菌。目前已證明為人畜共患病。,抵抗力,空腸彎曲菌抵抗力不強，易被干燥、直射日光及弱消毒劑所殺滅，56℃，5分鐘可被殺死。對紅霉素、新霉素、慶大霉素、四環(huán)

40、素、氯霉素、卡那霉素等抗生素敏感。近年發(fā)現(xiàn)了不少耐藥菌株。,致病性,在膽管中生長，小腸上端微需氧環(huán)境中適合本菌生長繁殖，造成空腸、回腸和大腸組織損傷，通過腸粘膜侵入血液。,檢驗程序,微需氧環(huán)境的制備：氧氣5%、氮氣85%、二氧化碳10%。（化學(xué)法、生物法、氣袋法、儀器法等）分離培養(yǎng)初步鑒定確定試驗,第十節(jié) 食品中致病性弧菌檢驗,弧菌是一大群菌體短小，彎曲成弧形的革蘭陰性菌。主要包括霍亂弧菌、副溶性弧菌和創(chuàng)傷弧菌。 大多數(shù)弧

41、菌源于海洋，是嗜鹽菌，嗜溫性。預(yù)防措施：徹底烹調(diào)或預(yù)煮，并防止交叉污染;控制原料收購;產(chǎn)品的適宜冷藏.,形態(tài)與染色,,涂片中,呈穿梭樣,運動非?；顫?液體中,排列整齊,呈魚群狀,革蘭染色陰性,弧型或逗點狀，,單鞭毛,霍亂弧菌（V.cholerae）,,培養(yǎng)特性,耐堿不耐酸,堿性瓊脂平板上生長良好,在pH8.8~9.0的,堿性蛋白胨水,,,根據(jù)O抗原不同,抗原構(gòu)造與分型,現(xiàn)已有155個血清群,其中O1群、O139群引起霍亂,根據(jù)表

42、型差異,O1群霍亂弧菌的每一個血清型,還可分為2 生物型,古典生物型,El Tor生物型,霍亂弧菌考核問題,抵抗力,不耐酸，在正常胃酸中僅能存活4分鐘,水中存活長，河水、井水、海水中1-3周,怕熱，100℃,1-2min死亡,霍亂腸毒素:,致病物質(zhì),激活GS，使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高，主動分泌Na+、K+、HCO3—和水，導(dǎo)致重的腹瀉與嘔吐,B亞單位,A亞單位,與小腸粘膜上皮細(xì)胞GM1神經(jīng)節(jié)苷脂受體結(jié)合，介導(dǎo)A亞單位進入細(xì)胞,,,,

43、（結(jié)合亞單位）,（毒性亞單位）,霍亂腸毒素的作用機理,1,2,3,4,霍亂腸毒素的作用機理,劇烈腹瀉和嘔吐（米泔水樣腹瀉物）， 大量水分和電解質(zhì)喪失 ，低容量性休 克及心力不齊和腎衰竭（死亡率高達(dá)60%）,烈性腸道傳染病，為我國的甲類法定傳染病,傳播途徑,主要是通過污染的水源或食物經(jīng)口攝入,所致疾病,,傳染源,臨床表現(xiàn),霍 亂,病人、無癥狀感染者,,,,上吐下瀉,,霍亂病人,免疫性,感染霍亂弧菌后，,機體可獲得牢固

44、免疫力,副溶血弧菌（V. parahaemolyticus ）,分布極廣的海洋細(xì)菌，為引起食物中毒重要的病原細(xì)菌之一，尤其是夏秋季節(jié)的沿海地區(qū)，經(jīng)常發(fā)生由于食用帶有大量副溶血性弧菌的海產(chǎn)品，引起暴發(fā)性食物中毒。嗜鹽性，在30~37℃最適溫度時增長較快，一般冬季不易檢出。,培養(yǎng)特性,需氧或兼性厭氧，對營養(yǎng)要求不高。最適NaCl濃度為35g/L，110g/L以上不生長，在無鹽培養(yǎng)基中不生長。最適pH為7.7~8.0。本菌的一個顯

45、著特征是：從患者分離的菌株在含有食鹽的血瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)β-溶血帶。這種能引起紅細(xì)胞溶解的現(xiàn)象稱為“神奈川試驗”。,抵抗力,不強。75℃，5min；90 ℃ ，1min即可殺死。對酸敏感。在食醋中5min死亡；1%醋酸1min可殺死。在淡水中才存活不超過2d，在海水中能存活47d。含鹽濃度低于0.5%或高于11%繁殖停止。,毒素耐熱性溶血毒素、不耐熱性溶血毒素、腸毒素。,致病性,,致病菌株可產(chǎn)生的耐熱性溶血素，能溶解人的紅細(xì)

46、胞，引起人的急性胃腸炎。攝入106個即可發(fā)病， 該菌經(jīng)烹飪不當(dāng)?shù)暮．a(chǎn)品或鹽腌制品所傳，潛伏期5~72小時，主要癥狀為腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐、發(fā)熱等。一般病程1~7d。,03年共采集41份魚蝦標(biāo)本，檢出副溶血性弧菌24份，檢出率為58.58%。其中魚類中副溶血性弧菌的檢出率為42.86%（9/21）；蝦類副溶血性弧菌檢出率為75%（15/20）。在三份市場活蝦的副溶血性弧菌的污染量達(dá)≥24000 MPN/1

47、00g、15000和11000MPN/100g。監(jiān)測結(jié)果表明主要腸道病原菌的菌相為副溶血性弧菌，占總病原菌的85.65%。顯示目前我省城市居民腸道病原菌以弧菌為主。,浙江CDC系統(tǒng)2003年 海水產(chǎn)品副溶血性弧菌定量檢測,檢驗步驟,樣品的采取分離培養(yǎng)選擇性培養(yǎng)涂片鏡檢嗜鹽試驗生化試驗動物試驗,第十一節(jié) 食品中耶爾森氏菌的檢驗,本菌為革蘭氏陰性桿菌或球桿菌 耶爾森氏菌屬包括11個種，其中對人有致病性的有三種：小腸結(jié)腸炎

48、耶爾森氏菌、假結(jié)核菌和鼠疫菌。只有小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和假結(jié)核菌已確定是食源性病原體。鼠疫耶爾森氏菌引起黑疽病，不通過食品傳染。,耶爾森氏菌食物中毒是近年來在國際上引起的一種腸道傳染病，至今已在世界上40多個國家發(fā)現(xiàn)。豬的帶菌率較高，日本報告檢出率為4%，加拿大為3.6%，丹麥為10-17%。在豬中，該菌最易在扁桃腺中發(fā)現(xiàn)。,七十年代在加拿大魁北克地區(qū)暴發(fā)過兩起，有138名兒童感染，源于攝入生牛奶。1976年在美國紐約爆發(fā)過一起，

49、有217名學(xué)生感染，在這起發(fā)病過程中涉及的是巴氏消毒巧克力奶。1980年發(fā)生于華盛頓的一起有87人感染，污染源是用未經(jīng)氯處理的泉水做的豆腐。由本菌引起的胃腸炎或中毒爆發(fā)，在歐洲以冬春季節(jié)較多，夏季較少，而日本則以夏季發(fā)病率較高。在我國福建省南部地區(qū)，該菌是冬春季腹瀉的重要病原菌.,致病性,耶爾森氏菌病典型癥狀常為胃腸炎癥狀、發(fā)熱、亦可引起闌尾炎。有的引起反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎，另一個并發(fā)癥是敗血癥，即血液系統(tǒng)感染，盡管較少見，但死亡率較高。本

50、菌對易染人群為嬰幼兒，常引起發(fā)熱、腹痛和帶血的腹瀉。本菌在0~4℃可以發(fā)育，是冰箱保藏食物潛在的危險病原菌。,檢驗程序,樣品的采集和處理；增菌培養(yǎng)；堿處理；分離培養(yǎng)；生化試驗。,第十三節(jié) 食品中肉毒梭菌的檢驗,肉毒梭菌生命力很強，并廣泛存在于自然界，特別是土壤中，易污染食品，于適宜條件下可在食品中產(chǎn)生劇烈的肉神經(jīng)毒素（又稱肉毒毒素），能引起以神經(jīng)麻痹為主要癥狀且死亡率極高的食物中毒。,肉毒素是目前所知的最強烈的細(xì)菌外毒素。故

51、肉毒梭菌的檢驗?zāi)繕?biāo)主要是其毒素。均以毒素的檢測及定型試驗為判定的主要依據(jù)。引起中毒的食品有臘腸、火腿、魚及魚制品和罐頭食品等。在美國以罐頭發(fā)生中毒較多，日本以魚制品較多，中國主要以發(fā)酵食品最多，如臭豆腐、豆瓣醬、面醬、豆其等。,抵抗力,肉毒梭菌加熱80℃，30min或100 ℃10mi n即可殺死。但其芽孢抵抗力強，煮沸后要6h，105 ℃2h，110 ℃36min，120 ℃4~5min才能將其殺死。,檢驗程序,樣品的采集和處

52、理；增菌培養(yǎng)；毒素檢測；分離培養(yǎng)。,第十四節(jié) 食品中蠟樣芽胞桿菌的檢驗,蠟樣芽孢桿菌分布廣泛，特別是在谷物制品中。主要通過泥土、灰塵、昆蟲、不干凈的食具和食品從業(yè)人員傳播。夏、秋季多發(fā)，中毒食品主要為剩米飯、米粉、甜酒釀、剩菜、甜點心及乳、肉類食品。中毒原因食品在食用前保存溫度較高（20℃以上）和放置時間較長。,蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生致吐腸毒素和致腹瀉腸毒素，前者耐熱。主要作用于胃腸道，引起胃腸功能紊亂。   

53、中毒表現(xiàn)：食用被蠟樣芽胞桿菌污染的食品后，一般在8~16小時內(nèi)出現(xiàn)中毒癥狀，可分為嘔吐型和腹瀉型，或兩者兼有。嘔吐型癥狀以惡心、嘔吐為主，并有頭暈、四肢無力等；腹瀉型以腹痛、腹瀉為主。中毒癥狀8~36小時可消失，一般不會導(dǎo)致死亡。    緊急處理：停止食用可疑污染的食品，多飲水。一般不需要使用抗生素治療。腹瀉較重者可到醫(yī)院就診。    中毒預(yù)防：蠟樣芽胞桿菌在15℃以下不繁殖，剩飯、剩菜應(yīng)放在

54、低溫保存。該菌污染的食品一般無腐敗變質(zhì)的異味，不易被發(fā)覺。因此，剩飯、剩菜在食用前一定要再加熱。注意食品的貯藏和個人衛(wèi)生，防止塵土、昆蟲及其他不潔物污染食品。,口服蠟樣芽孢桿菌活菌片,【適 應(yīng) 癥】主要用于嬰幼兒腹瀉、慢性腹瀉、腸功能紊亂及腸炎的治療。,檢驗程序,菌數(shù)測定；分離培養(yǎng)；證實試驗,第十五節(jié) 食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢驗,產(chǎn)氣莢膜梭菌為厭氧芽胞菌，是引起食源性胃腸炎最常見的病原之一?？梢鸬湫偷氖澄镏卸?、爆發(fā)。由產(chǎn)氣莢膜

55、梭菌引起的疾病為魏氏梭菌中毒?；颊吲R床特征是劇烈腹絞痛和腹瀉。 在食品中該菌數(shù)量必須達(dá)到很高時（1.0×107或更多），才能在腸道中產(chǎn)生毒素，已報導(dǎo)有少數(shù)病人因脫水和其它混合感染而導(dǎo)致死亡。,據(jù)美國人類衛(wèi)生教育福利部報導(dǎo)魏氏梭菌引起的食物中毒，在美國占細(xì)菌性食物中毒的30%左右，另據(jù)美國疾病控制中心，估計每年因產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的食物中毒約近1萬人，其中大約只報導(dǎo)1200例，暴發(fā)約20起，大量的暴發(fā)和少量的發(fā)病都與公共飲食有關(guān)

56、。例如：學(xué)校的自助食堂和護理病房，產(chǎn)氣莢膜梭菌中毒最常發(fā)生于兒童和老人。,產(chǎn)氣莢膜梭菌廣泛分布于環(huán)境中，經(jīng)常在人和許多家養(yǎng)及野生動物的腸道中發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌的芽胞，長期存在于土壤和沉淀物中，從牛肉、豬肉、羔羊、雞、火雞、燜肉、紅燒蔬菜，燉肉和肉汁中分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌，引起食物中毒的食品大多是畜禽肉類和魚類食物，牛奶也可因污染而引起中毒 。,本菌雖屬厭氧性細(xì)菌，但對厭氧程度的要求并不太嚴(yán)?！　≡谄胀ㄅ囵B(yǎng)基上能生長，若加葡萄糖，血液，則生長更好

57、。生長適宜溫度為37-47℃ 所有菌株均發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖及蔗糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，液化明膠，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，但也有例外。發(fā)酵牛奶中的乳糖、使牛奶凝固，同時大量產(chǎn)氣，凝塊碎裂，即所謂暴力發(fā)酵，這是本菌的主要生化特征之一，也是主要鑒別的指標(biāo)。,檢樣25g(mL)或稀釋液225mL↓SPS瓊脂混合傾注↓黑色菌落記數(shù)↓任挑黑色菌落10個,分別接種FT培養(yǎng)基↓確證試驗↓鏡 動 銷 牛 卵檢 力 酸 奶

58、 磷形 試 鹽 發(fā) 脂 態(tài) 驗 還 酵 分　　 原　 解↓菌落計數(shù),第十六節(jié) 食品中霉菌和酵母菌的檢驗,酵母和霉菌都是真菌，廣泛分布于自然界并可作為食品中正常菌相的一部分。長期以來，人們利用某些霉菌和酵母加工一些食品。但在某些情況下，霉菌和酵母菌也可以造成食品腐敗變質(zhì)。,由于他們生長緩慢和競爭力不強，故常常在不適于細(xì)菌生長的食品中出現(xiàn)，這些食品是pH低、濕度低、含鹽好含糖高的食品、低溫儲藏的食品、含有抗生素的食品等。

59、他們能抵抗熱、冷凍、以及抗菌素和輻照等儲藏技術(shù)，還能轉(zhuǎn)換某些不利于細(xì)菌的物質(zhì)，而促進致病菌的生長。有些霉菌能合成有毒代謝產(chǎn)物——霉菌毒素。因此，霉菌和酵母菌也可作為評價食品衛(wèi)生質(zhì)量的指示菌，并以霉菌和酵母菌計數(shù)來制定食品被污染的程度。,酵母菌,利用酵母菌釀酒、制造美味可口的飲料和營養(yǎng)豐富的食品（面包、鏝頭），生產(chǎn)多種藥品（核酸、輔酶Ａ、細(xì)胞色素Ｃ、維生素Ｂ、酶制劑等），進行石油脫蠟、降低石油的凝固點和生產(chǎn)各種有機酸。由于酵母菌細(xì)胞的

60、蛋白質(zhì)含量很高（一般大于細(xì)胞干重的50%），且含有多種維生素、礦物質(zhì)和核酸等，所以，人類在利用擬酵母、熱帶假絲酵母、白色假絲酵母、粘紅酵母等酵母菌處理各種食品工業(yè)廢水時，還可以獲得營養(yǎng)豐富的菌體蛋白。,當(dāng)然，也有少數(shù)酵母菌（約25種）是有害的，如魯氏酵母（Saccharomyces rouxii）、蜂蜜酵母（Saccharomyces mellis）等能使蜂蜜、果醬變質(zhì)，有些酵母菌是發(fā)酵工業(yè)污染菌，使發(fā)酵產(chǎn)量降低或產(chǎn)生不良?xì)馕叮绊懏a(chǎn)

61、品質(zhì)量，白假絲酵母（Candida albicans）又稱白色念珠菌）可引起皮膚、粘膜、呼吸道、消化道以及泌尿系統(tǒng)等多種疾病。新型隱球酵母（Cryptococcus neoformans）可引起慢性腦膜炎、肺炎等。,酵母菌的菌落特征,菌落表面濕潤、粘稠、易被挑起。有些種因培養(yǎng)時間太長使菌落表面皺縮。其色多為乳白，少數(shù)呈紅色，如紅酵母、擲孢酵母等。,啤酒酵母的菌落,紅酵母的菌落,各種酵母菌的菌落,霉菌,霉菌是絲狀真菌的統(tǒng)稱 。在自然界分布

62、極廣 ，與人類的關(guān)系密切，對人類有利也有害。有利的方面：食品工業(yè)利用霉菌制醬、制曲；發(fā)酵工業(yè)則用霉菌來生產(chǎn)酒精、有機酸（如檸檬酸、葡萄糖酸等）；醫(yī)藥工業(yè)利用霉菌生產(chǎn)抗生素（如青霉素、灰黃霉素等）、酶制劑（淀粉酶等）、維生素等；在農(nóng)業(yè)上可用霉菌發(fā)酵飼料、生產(chǎn)農(nóng)藥；此外，霉菌還可分解自然界中的淀粉、纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)等復(fù)雜大分子有機物，使之變成葡萄糖等微生物能利用的物質(zhì)，從而保證了生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)得以不斷循環(huán)。,霉菌對人類有害方面主要是

63、：使食品、糧食發(fā)生霉變，使纖維制品腐爛。據(jù)統(tǒng)計每年因霉變造成的糧食損失達(dá)2%； 霉菌能產(chǎn)生100多種毒素，許多毒素的毒性大，致癌力強，即使食入少量也會對人畜有害。,霉菌的菌落特征,菌落較疏松、常呈絨毛狀、絮狀或蜘蛛網(wǎng)狀 。菌落表面常呈現(xiàn)出肉眼可見的不同結(jié)構(gòu)和色澤特征，這是因為霉菌形成的孢子有不同形狀、構(gòu)造和顏色，有的水溶性色素可分泌到培養(yǎng)基中，使菌落背面呈現(xiàn)不同顏色；一些生長較快的霉菌菌落，處于菌落中心的菌絲菌齡較大，位于邊緣的則較年

64、幼。,青霉的菌落,各種曲霉的菌落,霉菌菌落周圍出現(xiàn)抑制萄葡球菌生長的抑制現(xiàn)象,產(chǎn)黃青霉菌落,細(xì)菌生長抑制區(qū)域,正常細(xì)菌生長區(qū)域,,,,檢驗方法,1．樣品的處理 2．樣品的稀釋 3．培養(yǎng)基的選擇 ：馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：霉菌和酵母在PDA培養(yǎng)基上生長良好。用PDA作平板計數(shù)時，必須加入抗菌素以抑制細(xì)菌。 孟加拉紅（虎紅）培養(yǎng)基 ；高鹽察氏培養(yǎng)基,4．傾注培養(yǎng) 5．菌落計數(shù)及報告 選取菌落數(shù)10~150之間的

65、平板進行計數(shù)。一個稀釋度使用兩個平板，取兩個平板菌落數(shù)的平均值，乘以稀釋倍數(shù)報告。固體檢樣以g為單位報告，液體檢樣以mL 單位報告。,思考題,1、何謂菌落總數(shù)？它有何衛(wèi)生學(xué)意義？2、何謂大腸菌群？它有何衛(wèi)生學(xué)意義？3、如何提高沙門氏菌的檢出率?4、沙門氏菌在三糖鐵培養(yǎng)基上的反應(yīng)如何？為什么？5、沙門氏菌檢驗有哪5個基本步驟？6、致病性大腸埃希氏菌有哪幾種？主要引起哪幾種癥狀的疾??？,7、金黃色葡萄球菌在BP平板上的菌落特征如何

66、？為什么？8、鑒定致病性金黃色葡萄球菌的重要指標(biāo)是什么？并敘述其試驗？9、簡述溶血性鏈球菌的檢驗程序？10、副溶血性弧菌檢驗的意義是什么？11、簡述小腸結(jié)腸耶爾森氏菌的檢驗方法？12、檢驗食品中的肉毒梭菌有何意義？13、肉毒梭菌有無芽孢？是需氧菌還是厭氧菌？,革蘭氏染色法,1.涂片固定,2.單染—結(jié)晶紫染液第一次染色 1min,,3.媒染—碘-碘化鉀溶液浸濕30S,,,,4. 脫色—95%乙醇溶液進行顏色洗脫,5.