碩士高級免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)概述

1、高級免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) 2019級碩士研究生,吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系袁紅艷,選用教材,免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課要求,不許遲到、早退、缺課。不允許擅自換教室。穿白大衣。愛護(hù)實(shí)驗(yàn)器材（使用后用水沖洗，然后放入指定地點(diǎn)），損壞者按價(jià)賠償。課后認(rèn)真打掃教室衛(wèi)生（擦地面和桌面）。關(guān)掉手機(jī)或設(shè)置為振動狀態(tài)。,實(shí)驗(yàn)分組,,實(shí)驗(yàn)操作內(nèi)容安排,淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)巨噬細(xì)胞吞噬功

2、能測定,自講安排,自講評分標(biāo)準(zhǔn),考核方式,,考核要求,自講自評（20分），每組成員合作準(zhǔn)備資料和上講臺講述，老師及其他組給評分，取平均成績，4人給相同的自講成績。綜合考試（40分），共四個(gè)大題，每題10分。（周五下午）出勤情況（10分），每4學(xué)時(shí)1分。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（30分），應(yīng)用免疫學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法，設(shè)計(jì)與自己專業(yè)的課題。（12.29之前上交，如能完成可在本周五上交）談?wù)勀銓Ρ敬蚊庖邔W(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的看法。包括:內(nèi)容安排、備課情況、

3、講授情況等的優(yōu)缺點(diǎn)、意見與建議。（最后一次課當(dāng)堂寫。）,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),應(yīng)用免疫學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法，設(shè)計(jì)與自己專業(yè)的課題。包括:1）題目2）研究內(nèi)容①②③3）研究方案①②③4）創(chuàng)新點(diǎn),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的原則,研究的題目：確定研究題目是開展研究工作的首要任務(wù)。研究摘要：研究背景，要開展的主要研究（利用什么樣的方法開展研究），研究意義（本次研究的預(yù)期成果及其推動科學(xué)進(jìn)步的作用）。研究內(nèi)容：敘述主要開展的工作。研究方案：利用什么樣的手段去解決研

4、究內(nèi)容提到的相關(guān)工作。研究的特色與創(chuàng)新之處：主要科學(xué)貢獻(xiàn)。,題目：XX細(xì)胞因子誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制研究摘要：肺癌是最常見的腫瘤之一。XX與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但其在肺癌中的作用仍缺乏報(bào)道。本研究采用人肺癌細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)分析XX誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞凋亡作用，通過分析Caspase3,8,12等確定XX誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制。本研究不僅可以進(jìn)一步揭示XX抗腫瘤作用機(jī)制，也為尋找新的肺癌治療方法提供研究基礎(chǔ)。,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本

5、思路,研究內(nèi)容：1）XX在人肺癌腫瘤細(xì)胞的表達(dá)分析，確定XX表達(dá)與肺腫瘤的關(guān)系。2）檢測患者血清XX水平，確定其輔助診斷肺癌的價(jià)值 研究方案：1）采用腫瘤組織切片，通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察XX在人肺癌組織中的表達(dá)情況。2）采用ELISA法檢測血清XX水平。研究的特色與創(chuàng)新之處：本研究闡述了XX與肺癌的關(guān)系，并提出XX可作為肺癌的血清學(xué)診斷標(biāo)志物，研究發(fā)現(xiàn)XX可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，并闡述了其作用機(jī)制。,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本思路,免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技

6、術(shù)概述,小調(diào)查-對免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的了解,目前你知道的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)有哪些？這些免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的原理是什么？這些技術(shù)有什么應(yīng)用？,免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)概述,免疫學(xué)技術(shù)的范疇,1、對具有免疫活性物質(zhì)的定性、定量測定2、對免疫系統(tǒng)的組成成分的數(shù)量、狀態(tài)的測定,免疫學(xué)檢測技術(shù)的評價(jià),一、評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Specificity（特異）Sensitivity（敏感）Simplicity（簡便）Safety（安全）Saving（節(jié)約）二、特

7、異性與敏感性的關(guān)系特異性高、敏感性低敏感性高、特異性低,免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)概述,抗原抗體反應(yīng)淋巴細(xì)胞的檢測技術(shù)細(xì)胞因子的檢測技術(shù)免疫學(xué)常用的分子生物學(xué)技術(shù),多克隆抗體單克隆抗體基因工程抗體 前兩者常用于實(shí)驗(yàn)研究，而后者用于臨床治療研究。,抗體的應(yīng)用,多克隆抗體是通過免疫動物血清分離獲得優(yōu)點(diǎn)：制備方法比較簡單，價(jià)格低廉，制備所需時(shí)間短等 在確定新基因編碼蛋白研究方面，仍然是首選抗體類型。但由于多克

8、隆抗體含有針對多個(gè)抗原表位的抗體成分，也可能包括抗原變性后暴露的新抗原表位，因此，多克隆抗體在檢測變性抗原——如采用Western Blot檢測蛋白時(shí)，其效果比單克隆抗體更敏感。,多克隆抗體,缺點(diǎn)：純度差易發(fā)生交叉反應(yīng)來源有限所產(chǎn)生的抗體因動物個(gè)體差異滴度不同不易標(biāo)準(zhǔn)化 因免疫動物血清中含有非常復(fù)雜的多種蛋白質(zhì)成分，所以在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室分析、檢測之前，必須將其有效的抗體成分分離、純化。,多克隆抗體,單克隆抗體(mA

9、b)是通過B細(xì)胞雜交瘤獲得與多克隆抗體相比，單克隆抗體主要具有以下三個(gè)顯著特點(diǎn)（優(yōu)點(diǎn)）： ①高度均質(zhì)性②高度特異性③來源穩(wěn)定不足：制備方法比較復(fù)雜，價(jià)格昂貴，制備所需時(shí)間較長。,單克隆抗體,mAb是由起始于一個(gè)B淋巴細(xì)胞的單克隆細(xì)胞系所分泌的，因此是一種每個(gè)抗體分子的結(jié)構(gòu)(包括氨基酸排列順序和空間構(gòu)型)都相同的均質(zhì)性抗體。,高度均質(zhì)性,,mAb只專一的識別抗原分子上單個(gè)抗原位點(diǎn)，因此容易獲得特異性抗體，較少產(chǎn)生交叉反應(yīng)。,高

10、度特異性,,可大量生產(chǎn)，當(dāng)?shù)玫椒€(wěn)定分泌mAb的雜交瘤細(xì)胞系后，可置液氮中長期保存，需要時(shí)取出復(fù)蘇，既可在體外培養(yǎng)中收獲mAb，也可將雜交瘤細(xì)胞接種入同系小鼠腹腔內(nèi)，然后從荷瘤小鼠的腹水中收獲大量mAb。,來源穩(wěn)定,,根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的不同，其分離、純化的純度要求也不同。作為ELISA檢測時(shí)的抗體，部分情況下飽和硫酸胺純化即可；最常使用的抗體是經(jīng)過A蛋白(Protein A)親和層析獲得的IgG型抗體；免疫放射測定的標(biāo)記用抗體必須達(dá)到雙

11、級純才可應(yīng)用(親和層析純+SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳純)。,純度要求,單克隆抗體在制備過程中經(jīng)過嚴(yán)格的篩選，因此應(yīng)根據(jù)不同的應(yīng)用目的選擇不同單克隆抗體亞類，如標(biāo)明供ELISA檢測用的單克隆抗體，可能不適合Western Blot檢測。作為初學(xué)者尤其應(yīng)該注意各類單克隆抗體標(biāo)明的應(yīng)用范圍，而多克隆抗體一般情況下均有較寬的適用范圍。,適用范圍,一抗和二抗,一級抗體：抗原特異性的抗體二級抗體：抗抗體（針對一抗的Fc段，具有種屬特異性）,Ag,