基因診斷

1、1,第 10 章 基因診斷 Gene diagnosis China Medical University Department of Medical Genetics,,p480,2,本章內(nèi)容提示,基因診斷概念 基因診斷方法 直接診斷（Southern）

2、 間接診斷（PCR-RFLP） DNA多態(tài) 　 基因診斷 實(shí)例：,3,第一節(jié) 基因診斷技術(shù) 第二節(jié) 基因診斷方法及實(shí)例,4,基因診斷： 利用分子生物學(xué)技術(shù)從DNA 水平檢測人類遺 傳性疾病的基因缺陷，又稱DNA分析法。 傳統(tǒng)的診斷：表現(xiàn)型→基因型 基 因 診 斷：基因型→表現(xiàn)型 （ 逆向診斷）,5,基因診斷的

3、特征：,,1 不受材料來源影響 外周血、活體穿刺組織、孕婦外周血、血斑等2 癥狀前診斷 尤其對于一些延遲顯性疾病如Huntingtong舞蹈病3 產(chǎn)前診斷 避免患兒出生，提高人口質(zhì)量,6,第一節(jié) 基 因 診 斷 技 術(shù),Southern印跡雜交,7,基 因 診 斷 技 術(shù),Northern印跡雜交,8,基 因 診 斷 技 術(shù),斑 點(diǎn) 雜 交,,,,,,,,,,,

4、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,點(diǎn)樣,Probe-32P,檢測,AB,1 2 3 4,9,基 因 診 斷 技 術(shù),熒光原位雜交,10,基 因 診 斷 技 術(shù),熒光原位雜交,11,基 因 診 斷 技 術(shù),聚合酶鏈反應(yīng),12,基 因 診 斷 技 術(shù),聚合酶鏈反應(yīng),13,基 因 診 斷 技 術(shù),☆ 多重PCR,在一個(gè)PCR體系中加入數(shù)對PCR引物，覆蓋區(qū)域不重疊用于檢測同一基因多個(gè)外顯子

5、的缺失,,,,,,E1 E2 E3,,,,,,,14,基 因 診 斷 技 術(shù),☆ RT-PCR,,以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA用于研究基因表達(dá)使微量mRNA迅速擴(kuò)增，提高mRNA檢出的靈敏度,15,基 因 診 斷 技 術(shù),☆ PCR-SSCP（Single Strand Conform

6、ation Polymorphism）,單鏈DNA由于堿基序列不同可引起構(gòu)象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率的不同。據(jù)此，可用于DNA中單個(gè)堿基的替代、微小的缺失或插入的檢測。,16,基 因 診 斷 技 術(shù),--------------------------- primer ---------------------------

7、 ↓ 32P-dNTP摻入 PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物 ↓ 變性 ↓ 單鏈DNA ↓

8、 中性聚丙烯酰胺凝膠電泳  ↓ 1 2 3 4 5 自顯影 ↓

9、 1為正常 結(jié)果分析 2、4、5為純合患者 3為雜合子

10、 .,,,,,,,,,,,,,,,,17,基 因 診 斷 技 術(shù),生 物 芯 片,18,第二節(jié) 基 因 診 斷 方 法及實(shí)例,直接診斷——直接檢測致病基因的突變 基因突變類型——缺失、點(diǎn)突變、重復(fù)、插入等,間接診斷——應(yīng)用DNA多態(tài)為遺傳標(biāo)記進(jìn)行連鎖 分析，確定待測者是否得到帶有致病的染色體，從而間接地作出診斷 DNA多態(tài)——RFLP、VNTR、SNP,19,一 DNA多態(tài)

11、,DNA多態(tài)（DNA Polymorphism）： 群體中每個(gè)個(gè)體DNA區(qū)域中等位基因（或片段）存在兩種或兩種以上的形式，對基因功能沒有影響，稱DNA多態(tài)。 它通過孟德爾方式遺傳。常用做遺傳分析中的標(biāo)記。,20,DNA分析中常用的遺傳性多態(tài)性標(biāo)記有3類：,1）RFLP：稱限制性片段長度多態(tài)性，為第一代多態(tài)性標(biāo)記；2）重復(fù)序列多態(tài)性（VNTR）：如短串聯(lián)重復(fù)序列（STR），為第二代多態(tài)性標(biāo)記；3

12、）單堿基多態(tài)性（SNP）：DNA序列的單個(gè)核苷酸的差別，為第三代多態(tài)性標(biāo)記。,21,一) 限制性片段長度多態(tài)性,Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLP由于堿基變異可能導(dǎo)致限制酶切點(diǎn)消失或新的酶切點(diǎn)出現(xiàn)，引起不同個(gè)體DNA在用同一限制酶切割時(shí)，產(chǎn)生不同長度的DNA片段，稱 RFLP RFLP按孟德爾（共顯性）方式遺傳，是非常有用的遺傳標(biāo)記。,22,Allele II 產(chǎn)生了新

13、的酶切點(diǎn),,,,,,,,Allele I,Allele II,12Kb,8Kb,4Kb,,probe,,,,12Kb,8Kb,RFLP—Southern blot檢測結(jié)果,23,AlleleII酶切位點(diǎn)消失,,24,二)數(shù)目變異串聯(lián)重復(fù)，variable number tandem repeats, VNTR）,重復(fù)序列以各自的核心序列（重復(fù)單元），首尾相連多次重復(fù)，稱為串聯(lián)重復(fù)序列，其重復(fù)次數(shù)在人群中存在變異，形成多態(tài)即 VNTR。

14、散在分布于染色體上。重復(fù)單位6~25bp長，稱為小衛(wèi)星DNA。重復(fù)單位2~6bp長，如（TA）n, (CGG)n等，稱為微衛(wèi)星DNA。,25,VNTR兩側(cè)酶切位點(diǎn)固定，但兩酶切點(diǎn)之間的串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)不同，酶切后產(chǎn)生不同長度的片段。DNA多態(tài)可以通過PCR擴(kuò)增后電泳來檢出，稱擴(kuò)增片段長度多態(tài)（amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP）,26,VNTR 酶切，電泳后的檢測結(jié)果,,,

15、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,大,小,27,PCR-VNTR檢測,,28,PCR-VNTR,,29,30,三)單核苷酸多態(tài)性（SNP）（Single Nucleiotide Polymorphism）,SNP：發(fā)生在基因組中的單個(gè)核苷酸的替代　　根據(jù)SNP在基因中的位置，分為： 基因編碼區(qū)SNP 基因周邊SNP

16、 基因間SNP在人類基因組中每100~300個(gè)核苷酸就有一個(gè)SNP,,,,,31,二、基診斷方法及實(shí)例,直接檢測致病基因本身的異常。通常使用基因本身或鄰近DNA序列作為探針，進(jìn)行Southern 雜交，或通過PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，以檢測基因點(diǎn)突變、缺失、插入等異常及性質(zhì)。主要適用于已知基因異常疾病的診斷。,直接基因診斷及實(shí)例,32,直接基因診斷— 突變型遺傳病的直接基因診斷,e.g.

17、 鐮形細(xì)胞貧血的Gene診斷,33,1）Southern blot β珠蛋白鏈基因第6位密碼子發(fā)生突變 GAG——GTG 谷Aa——纈Aa,e.g. 鐮形細(xì)胞貧血的Gene診斷,34,,已知限制酶Mst 1識別序列 （CCTNAGG） CCTGA

18、GG CCTGTGG突變后不能識別，酶切位點(diǎn)消失，限制酶切片段長度發(fā)生變化。,,,35,2) ASO探針診斷,已知突變Gene部位和性質(zhì)，合成寡核苷酸探針，32P標(biāo)記，進(jìn)行斑點(diǎn)雜交。 Normal βΑGen

19、e Probe——與正常 Probe βΑ雜交穩(wěn)定 Mutation βS Gene Probe——與異常 βS雜交 穩(wěn)定,,36,等位基因特異性寡核苷酸探針（ASO）（Allele-specific-oligonucleotide ）,37,斑點(diǎn)雜交結(jié)果：,βΑ/βΑ βΑ/βS βS/βS

20、 正常探針 突變探針,,,,,,,,,,突變型遺傳病的直接基因診斷,38,突變型遺傳病的直接基因診斷,39,,,,,,,,,,,BamHI,BamHI,α2,α1,α2,,,,,10 kb,

21、,,,14 kb,,probe,1） ?地中海貧血的基因診斷,?基因不同程度的缺失可引起不同類型的?地中海貧血。,直接基因診斷— 缺失型遺傳病的直接基因診斷,40,Southern blot 檢測結(jié)果：,αα/αα αα/α- αα/- - α- /- - - - / - - 正常 缺1 缺2 缺3 缺4,,,,14kb

22、,10kb,,,,,,缺失型遺傳病的直接基因診斷,41,,2）β地貧的Gene診斷β珠蛋白基因兩側(cè)有pst1酶切位點(diǎn)， pst1酶切正常可得到4.4kb片段β珠蛋白基因缺失0.7kb片段， pst1酶切則得到3.7 kb片段為β0,缺失型遺傳病的直接基因診斷,42,以βGene為探針，Southern blot 方法檢測,βΑ/βA βΑ/β0 β0/β0,,,,4.4kb,3.7kb,,,,,,缺失型遺傳病的直接基因診斷

23、,43,,3） DMD的基因診斷,DMD屬XRDMD基因是最大的基因，有79個(gè)外顯子DMD基因突變主要以缺失為主，可涉及基因的不同部位,,,,,,E1 E2 E3,,,,,,,缺失型遺傳病的直接基因診斷,44,,,病例,外顯子,,1 2 3 4

24、 5 6 7 8,Pm34350136476052,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,bp,535,113,,缺失型遺傳病的直接基因診斷,45,二）間接基因診斷方法及實(shí)例,當(dāng)致病基因雖然已知，但其異常性質(zhì)未知時(shí)，或疾病Gene本身尚未知時(shí)，主要通過Gene和DNA多態(tài)的

25、連鎖分析間接地作出診斷。,46,連鎖分析基于遺傳標(biāo)記與Gene在染色體上連鎖， 通過對受檢者及其家系進(jìn)行連鎖分析，分析子代獲得某種遺傳標(biāo)記與疾病的關(guān)系，間接推斷受檢子代是否獲得帶有致病基因的染色體，間接地判斷并做出診斷。 遺傳標(biāo)記是基因組中的DNA 多態(tài) 如：RFLP，VNTR 等。,間接基因診斷,47,,,,,,,遺傳標(biāo)記,,相關(guān)基因,,表型分析,,,,間接基因診斷,48,1 Sou

26、thern blot--RFLP診斷(PKU),PAH基因兩側(cè)有Msp1酶切位點(diǎn),用該酶消化可產(chǎn)生23kb、19kb 兩種等位片段，以PAHcDNA為探針與PKU家系成員外周血DNA雜交。,間接基因診斷,49,患者為19kb片段的純合子,說明患者缺陷的PAH基因與19kb片段連鎖其父、母親缺陷的PAH基因與19kb片段連鎖，其23kb片段與正常PAH基因連鎖。II2為23kb 和19kb片段的雜合子，為表型正常的致病基因攜帶者。,間

27、接基因診斷,50,2 成年型多囊腎病的診斷,例：成年型多囊腎病——APKD，AD ，臨床表現(xiàn)為腰痛，蛋白尿，血尿，高血壓，腎盂性腎炎，腎結(jié)石。最終導(dǎo)致腎功能衰竭和尿毒癥。APKD——Gene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和疾病發(fā)病機(jī)理也尚未闡明，但已證實(shí)APKD Gene與α珠蛋白基因3`端附近的一段小衛(wèi)星DNA序列（3`HVR）緊密連鎖，因此，可以通過ＲＦＬＰ連鎖分析進(jìn)行診斷。,間接基因診斷,51,以3`HV

28、R為探針，與PvuII酶切后的家系有關(guān)成員的基因組DNA進(jìn)行Southern Blot,基因組DNA,,PvuII酶切,DNA片段,,變性,轉(zhuǎn)膜,探針,,變性,,雜交,,結(jié)果分析,間接基因診斷,52,1 2 1 2 3 4 5 5.7kb 3.4kb 2.3kb,,,,,,

29、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,間接基因診斷,53,結(jié)果分析,患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段，說明致病基因與3.4kb片段連鎖，并按孟德爾方式遺傳。II5不含3.4kb片段，產(chǎn)前診斷正常。,間接基因診斷,54,3 甲型血友病診斷（PCR—RFLP）,甲型血友病的基因診斷：已知甲型血友病XR，獲得家系成員基因組DNA 。 PCR 142 bp BcLI

30、 142bp 99 bp 43bp 電泳 結(jié)果分析,,,,,,,,,,,p1,p2,142bp,99bp,43bp,Bcl I,Bcl I -,Bcl I +,間接基因診斷,55,間接基因診斷,56,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,142bp,99bp,,1 2,,1,,,2,3,,,,,,,,,,Ⅰ,Ⅱ,III,1,間接基因診斷,57,結(jié)果分析,1）

31、先癥者II 1具有99bp片段而發(fā)病，該片段來自母親。2）II2有142bp/99bp，為雜合子。142bp來自父親，為正常片段，99bp片段是來自母親而成為攜帶者。3）Ⅲ1為99bp片段 如果是 男性 為患者（99bp片段來自母親）；女性為攜帶者（來自父母雙方）,間接基因診斷,58,單體型分析,有時(shí)用一種酶和一個(gè)探針不能提供可供分析的信息，需采用一種以上的酶結(jié)合幾個(gè)基因探針雜交分析。根據(jù)同一條染色體上限制性位點(diǎn)的丟失或獲得

32、而出現(xiàn)的一組多態(tài)位點(diǎn)所構(gòu)成的不同片段長度的組合類型進(jìn)行分析，該分析方法稱單體型分析（Haplotyping),間接基因診斷,59,舉例：PKU家系Hind Ⅲ 酶切： 患兒4.2/4.0kb雜合體 父母4.2/4.0kb雜合體 均為雜合體，無法分析。再用sphⅠ酶切：患兒 純合7.0kb

33、 父親 純合7.0kb 母親 9.7kb和7.0kb雜合體,間接基因診斷,60,結(jié) 果,1 2 1 2 3 4.2kb

34、 4.0kb　 11kb 9.7kb 7.0kb,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,I,II,,,,,,,,,,,,,Hind Ⅲ,Sph Ⅰ,間接基因診斷,61,分析： 患兒Ⅱ1從母親和父親各獲得一個(gè)7.0kb突變型從Hind Ⅲ 酶切結(jié)果看出： 正常同胞Ⅱ3為純合4.0kb ，也是sphⅠ 7.0kb純合體，故母親H 4.0kb S 7

35、.0kb 構(gòu)成單體型，母親7.0kb為突變型，因此，母親H 4.0kb S 7.0kb為突變單體型。,間接基因診斷,62,患兒Ⅱ1為Hind Ⅲ 4.2/4.0kb雜合體， 故父親H 4.2kb S 7.0kb 為突變單體型母親H 4.2kb S 9.7kb 和父親H 4.0kb S 7.0kb 為正常單體型。Ⅱ2 兩個(gè)單體型分別為H 4.2kb S 9.7kb（母）和H 4.0kb S 7.0kb（父） 正常個(gè)體Ⅱ3兩個(gè)單體