胡繼紅下呼吸道感染細(xì)菌培養(yǎng)操作規(guī)范花臉稿解讀

1、,,,Standard for Bacterial Culture Proceduresof Lower Respiratory Tract Infections,主要起草人：衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心 胡繼紅,? 大多數(shù)微生物室：40-60%/日? 標(biāo)本是否合格？? 定植菌？致病菌？? 生長不同種類細(xì)菌如何報(bào)告？? 生長不同數(shù)量細(xì)菌取舍？? 前后兩天培養(yǎng)結(jié)果? 培養(yǎng)結(jié)果與臨床診斷,標(biāo)本最多判斷難

2、報(bào)告難不符合,,,,,草綠色鏈球菌、奈瑟菌屬嗜血桿菌屬、莫拉菌屬常見引起細(xì)菌性社區(qū)感染典型肺炎病原菌：,上呼吸道正常菌群,? 肺炎鏈球菌? 流感嗜血桿菌? 金黃色葡萄球? 卡他莫拉菌,?肺炎支原體?肺炎/鸚鵡熱衣原體?嗜肺軍團(tuán)菌?柯克斯體（Q熱）,痰的來源？是否被上呼吸道污染？

3、細(xì)胞內(nèi)病原引起非典型肺炎：,,?????????,衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心陜西省人民醫(yī)院安徽省立醫(yī)院衛(wèi)生部北京醫(yī)院北京大學(xué)人民醫(yī)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院解放軍總醫(yī)院浙江省溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院,胡繼紅任健康馬筱玲胡云建王輝徐英春蘇建榮羅燕萍李向陽,,1 美國微生物學(xué)會:《臨床微生物學(xué)操作手冊》（第3版）.2007.,（Clini

4、cal Microbiology Procedures Handbook）,2 美國微生物學(xué)會:《下呼吸道感染》臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)及操作系列叢書.2004,3 葉應(yīng)嫵, 等.全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第3版). 2006,4 美國微生物學(xué)會:《臨床微生物學(xué)手冊》(第10版).20115 美國微生物學(xué)會:《臨床微生物學(xué)手冊》(第9版).2006,6 Nagendra, S., P.Bourbeau, S.Brecher, M.Dunne

5、, M.LaRocco, and G.Doern.2001.Samplingvariability in the microbiological evaluation of expectorated sputa and endotrachealaspirates. J. Clin. Microbiol.39:2344-2347.,7 Roson,B.,J.Carratala,R.verdaguer,J.Dorca,F.Manre

6、sa,and F.Gudiol.2000.Prospective study ofsputum Gram stain in the initial approach to community-acquired pneumonia requiringhospitalization.Clin.Infec.Dis.31:869-874.,8 Gleckman,R.,J.DeVita,D.Hibert,C.Pelletier,and R

7、.Martin.1988.Sputum gram stain assessment,in community-acquired bacteremic pneumonia.J.Clin.Microbiol.26:846-849.,,?,應(yīng)用范圍：針對醫(yī)療機(jī)構(gòu)微生物實(shí)驗(yàn)室；,? 檢驗(yàn)項(xiàng)目：常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)檢測下呼吸道感染病原菌；? 操作流程：按分析前、分析中和分析后的順序書寫；? 引言：是全篇的背景知識；? 三個(gè)“規(guī)范性附錄”：結(jié)果報(bào)告的

8、重要依據(jù)。? 內(nèi)容——? 定性培養(yǎng)——痰/氣管吸出物；? 定量培養(yǎng)——支氣管纖維鏡采集標(biāo)本；? 快速排除和鑒別——重要致病菌的方法；? QC——培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量控制；? 細(xì)菌培養(yǎng)報(bào)告——需結(jié)合革蘭染色涂片結(jié)果；報(bào)告的臨床意義和格式內(nèi)容。,（1）明確：下呼吸道標(biāo)本 適合診斷的病原和檢驗(yàn)項(xiàng)目 ；（ 2 ）規(guī)定：細(xì)菌培養(yǎng)項(xiàng)目需同時(shí)做革蘭染色涂片——（ 培養(yǎng) + 藥敏 + 涂片）；（ 3 ）規(guī)范：痰培養(yǎng) / 氣管吸出物

9、的 定性培養(yǎng) 程序、氣管鏡采集標(biāo)本的 定量培養(yǎng) 程序；（ 4 ）明確：報(bào)告 的臨床意義和格式內(nèi)容 。,分析前分析中,標(biāo)本的采集、運(yùn)送定性、定量培養(yǎng)、涂片流程,標(biāo)本初篩、合格判斷病原菌篩查和鑒定、質(zhì)量控制,分析后,染色、培養(yǎng)結(jié)果報(bào)告（致病菌、非致病菌）、結(jié)果解釋,,,???1.2.3.,人類口咽部定植：需氧菌、兼性厭氧菌和厭氧菌等微生物；菌群總數(shù)：1010 ～1012CFU

10、/mL;健康人咽部定植菌特點(diǎn)：菌量～最少；需氧的正常菌群組成：革蘭陽性菌為主；影響因素：人體基礎(chǔ)條件變化影響定植菌群的種類和數(shù)量；（微生態(tài)）,舉例：長期接觸攜帶定植菌人群菌群會變化，如日托兒童的父母的肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌（具侵襲性）定植數(shù)量會增加；,?,基礎(chǔ)條件變化：使用免疫抑制劑、慢性肺病、廣譜抗菌藥物治療或住院患者等人群中，革蘭陰性桿菌的優(yōu)勢明顯增加。,,,,,,常見因素：,住院患者（48h后）

11、：,?病毒感染?抗菌藥物?損害?侵入性儀器,??????,——繼發(fā)細(xì)菌感染——?dú)⑺?、抑制正常菌群，使G-b、耐藥菌過度繁殖，如大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、不動(dòng)桿菌、陰溝腸桿菌等；定植菌：腸道菌，MRSA，多重耐藥菌——機(jī)械通氣（ICU）嗜麥芽窄食單胞菌鮑曼不動(dòng)桿菌,引起醫(yī)院獲得性感染,1）肺部感染的最常見機(jī)制：,肺泡內(nèi)吸入了口咽部定植菌；,? 吸入性肺炎患者咽

12、部菌群種類： 多侵襲性細(xì)菌或耐藥細(xì)菌，如肺炎鏈球菌或革蘭陰性桿菌。,? 清除機(jī)制：,健康宿主吸入口腔定植菌后常無臨床癥狀，細(xì)菌,通常被粘液柱狀纖維清除。? 吸入能否引起肺部感染取決于： 吸入菌的致病性及數(shù)量；患者免疫系統(tǒng)；呼吸道功能等諸方面的因素。2）吸入氣溶膠肺部感染占第二位： 主因：使用了不清潔的呼吸機(jī)。,3）血液播散性肺炎占第三位：,感染通常造成雙肺下葉肺炎。由呼吸道感染引發(fā)的菌血癥占12%，因此對

13、肺部感染的高熱患者送檢血培養(yǎng)，有利于發(fā)現(xiàn)肺部感染的病原菌。,,,注1：肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌是引起兒童和老年人肺炎的最常見致病菌；卡他莫拉菌、腦膜炎球菌多發(fā),于:,基礎(chǔ)病患者或病毒感染后的繼發(fā)感染；金黃色葡萄球菌肺炎可引發(fā)肺膿腫；肺炎克雷伯菌大葉性肺炎常合并膿腫或肺粘連，死亡率較高。,,注2：通?？捎梅肿由飳W(xué)方法快速診斷，也可在感染后期用血清學(xué)方法檢測肺炎支原體、肺炎衣原體和軍團(tuán)菌屬抗體確診。由生物恐怖病原菌，如和鼠疫耶

14、爾森菌引起的感染，血清學(xué)檢測可作為輔助診斷方法。結(jié)核分枝桿菌可用羅氏培養(yǎng)基或快速結(jié)核桿菌液體培養(yǎng)儀培養(yǎng)，或分子診斷方法檢測。,注3：暴露在特殊氣溶膠環(huán)境：與飛沫有關(guān)的結(jié)核分枝桿菌、與塵暴和鳥排泄物有關(guān)的雙相真菌等。,,??,除引起社區(qū)非典型肺炎的病原不能常規(guī)培養(yǎng)外，其他常見肺部感染的病原菌均可常規(guī)培養(yǎng)方法分離；但培養(yǎng)方法敏感性低，無法判斷分離菌的來源。,? 涂片革蘭染色方法：,????,評

15、價(jià)痰標(biāo)本是否合格；提高病原菌診斷的特異性；涂片還可發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)不能生長的細(xì)菌。涂片方法提高了培養(yǎng)方法的特異性及敏感性。,,,,,4.支氣管纖維鏡標(biāo)本定量培養(yǎng)的臨床意義,,,,3.1 標(biāo)本采集,3.1.1 咳痰,3.1.2 氣管吸出物,注：僅當(dāng)出現(xiàn)肺炎的臨床表現(xiàn)（如發(fā)熱或浸潤）時(shí)采集氣管吸出物標(biāo)本，否則勿培養(yǎng)氣管吸出物，因氣管在插管 24h 后即有定植菌，培養(yǎng)結(jié)果,可能與疾病不符。,3.1.3 血培養(yǎng),注：當(dāng)下呼吸道感染患者伴

16、有高熱癥狀時(shí)，送檢血培養(yǎng)（具體參考血培養(yǎng),標(biāo)本采集和送檢要求）,3.1.4 誘導(dǎo)痰（通常不用于細(xì)菌培養(yǎng)）3.1.5 氣管鏡標(biāo)本,3.1.5.1 采集氣管鏡標(biāo)本注意事項(xiàng)3.5.1.2 支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本(BAL)3.5.1.3 保護(hù)毛刷(PSB),,3.2 標(biāo)本運(yùn)送注 1 ：若送檢標(biāo)本超過 2h，將導(dǎo)致有臨床意義的致病菌數(shù)量減少，非苛養(yǎng)的口咽部定植菌過度生長。為防止口咽部正常菌群的過度生長，可將標(biāo)本放置 2 ℃～ 8 ℃環(huán)境

17、，但培養(yǎng)分離到肺炎鏈球菌等苛養(yǎng)菌的機(jī)會和數(shù)量會減少。注 2 ：若標(biāo)本延遲送檢超過 2h后未冷藏（超過 2h～24h， 2 ℃～ 8 ℃），應(yīng)在報(bào)告中說明因延誤送檢標(biāo)本，可能對培養(yǎng)結(jié)果造成的影響。,3.3,篩選并拒收下呼吸道細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本,??????,拒收24h內(nèi)重復(fù)采集的痰細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本唾液鼻沖洗液和分泌物、鼻孔拭子咽部標(biāo)本未經(jīng)保護(hù)套管收集的支氣管刷培養(yǎng)標(biāo)本痰的厭氧菌培養(yǎng)標(biāo)本,注：除支氣管穿刺吸出物

18、、 PSB 、活檢標(biāo)本、胸水或其他未經(jīng)污染以外的標(biāo)本做厭氧菌培養(yǎng)均不合格。,?,誘導(dǎo)痰,注：誘導(dǎo)痰標(biāo)本只適用于檢測卡氏肺孢子菌和結(jié)核分枝桿菌，對其他病原菌檢出效果差。,,4.1 痰及氣管吸出物標(biāo)本處理4.1.1 標(biāo)本處理要求,???,接種標(biāo)本及涂片操作必須在Ⅱ級生物安全柜中進(jìn)行；應(yīng)盡快處理所有標(biāo)本，特別是來自急診、新入院患者和有創(chuàng)方法采集的標(biāo)本（如：BAL和肺活檢標(biāo)本），以保證致病菌的活性，避免造成重復(fù)采集標(biāo)本；

19、使用全自動(dòng)接種前處理系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室按廠家說明書處理標(biāo)本，洗痰、液化后自動(dòng)接種和涂片,革蘭染色。4.1.2 接種標(biāo)本4.1.3 培養(yǎng)4.1.4 標(biāo)本涂片及革蘭染色注 1 ：革蘭染色脫色時(shí)間因選用不同的脫色劑而異。 1 ） 95% 乙醇脫色時(shí)間為 30s ； 2 ） 丙酮- 乙醇（體積比為 3:7, 棕色瓶室溫保存，有效期 1 年）脫色時(shí)間 1s ～5s ，脫色效果一致性好；3 ） 丙酮 （試劑純）脫色時(shí)間最短，

20、當(dāng)標(biāo)本中含大量宿主細(xì)胞時(shí)脫色效果好。注 2 ：使用革蘭染色儀染色的實(shí)驗(yàn)室按照廠家操作說明書進(jìn)行，注意條件優(yōu)化，使涂片染色結(jié)果達(dá)到滿意效果。4.1.5顯微鏡觀察革蘭染色結(jié)果?,,4.2 氣管鏡標(biāo)本處理,4.2.14.2.24.2.34.2.44.2.5,支氣管肺泡灌洗液定量培養(yǎng)保護(hù)毛刷定量培養(yǎng)接種其他培養(yǎng)基并培養(yǎng)革蘭染色標(biāo)本處理剩余BAL標(biāo)本可用于其他病原檢測（標(biāo)本珍貴）,對剩余BAL標(biāo)本離心后

21、，可根據(jù)需要進(jìn)行病毒、分枝桿菌、軍團(tuán)菌和真菌培養(yǎng)；或做病毒、卡氏肺孢子菌、抗酸染色和真菌涂片染色 .4.3 連續(xù)培養(yǎng)并觀察慢生長菌,,適用于檢測條件致病菌的所有項(xiàng)目,,只用于診斷細(xì)菌性肺炎，定量培養(yǎng)和革蘭染色,,4.4 分離并鑒定下呼吸道重要致病菌（參見附錄C）,“常見可疑菌落形態(tài)及經(jīng)典快速鑒定方法(16種)”,4.4.1鏈球菌屬,4.4.2苛養(yǎng)革蘭陰性桿菌（在麥康凱平板上難生長）4.4.3革蘭陰性雙球菌,4.4.4

22、革蘭陰性桿菌（在麥康凱平板上生長良好）4.4.5葡萄球菌屬4.4.6腸球菌屬,4.4.7革蘭陽性桿菌4.4.8鑒定絲狀真菌,4.4.9涂片時(shí)可見但培養(yǎng)不生長的細(xì)菌,,,4.5質(zhì)量控制,4.5.1革蘭染色4.5.2抗酸染色4.5.3培養(yǎng)基4.5.4試劑,4.5.4.1每批號、每周需做質(zhì)控的試劑,4.5.4.2每批號、每次試驗(yàn)需做質(zhì)控的試劑,,5.1 革蘭染色報(bào)告,5.1.1痰標(biāo)本報(bào)告原則（見表1）,“痰 / 氣管吸出物標(biāo)

23、本涂片革蘭染色結(jié)果解釋”,5.1.2 BAL細(xì)胞離心涂片報(bào)告5.2 報(bào)告有臨床意義的微生物,5.2.1應(yīng)報(bào)告的病原菌 （致病菌）,5.2.2培養(yǎng)和涂片相符合時(shí)報(bào)告的病原菌（與感染相關(guān)的定植菌）5.2.3有臨床意義的數(shù)量,5.2.4報(bào)告有臨床意義數(shù)量的非優(yōu)勢菌5.2.5報(bào)告有臨床意義數(shù)量的優(yōu)勢菌,5.3 對非致病菌的報(bào)告,5.3.1報(bào)告“腸桿菌科細(xì)菌”5.3.2報(bào)告“非發(fā)酵細(xì)菌”,5.3.3只生長腸球菌和凝固酶陰性葡萄球菌5.3

24、.4報(bào)告“分離到口咽部正常菌群”,5.4 平板上無細(xì)菌生長5.5 結(jié)果解釋,不接受培養(yǎng),可接受培養(yǎng),提示感染,特征性,提示與感染相關(guān)的病原菌,注意！,,,,用革蘭染色來評估呼吸道標(biāo)本是否合格,?>10鱗狀上皮細(xì)胞/LPF——標(biāo)本來自上呼吸道,彈性纖維，中性粒細(xì)胞多，鱗狀上皮細(xì)胞少，有代表性的好標(biāo)本,,,,你看見多少種形態(tài)？,幾種細(xì)菌的混合形態(tài)，缺乏鱗狀上皮細(xì)胞=混合厭氧菌感,染。如果是呼吸道標(biāo)本可能是吸入性肺炎。報(bào)告臨床醫(yī)

25、生“提示吸入性肺炎”,,,細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌,,,在使用抗生素之后鏈球菌常形態(tài)變得特別奇怪,,,,,呼吸道標(biāo)本中未被染色的，,有折射的桿菌=抗酸桿菌,,5.2.1 應(yīng)報(bào)告的病原菌,? 化膿鏈球菌,? B群β-溶血鏈球菌（兒童）,? 博德特菌屬，特別是支氣管博德特菌? 奴卡菌屬,? 新生隱球菌,? 弗朗西斯土拉菌（高致病菌）? 鼠疫耶爾森菌（高致病菌）? 炭疽芽孢桿菌（高致病菌）? 絲狀真菌（排除腐生菌污染）,,處理培養(yǎng)物應(yīng)參考涂片的

26、結(jié)果，應(yīng)根據(jù)革蘭染色所見炎癥細(xì)胞和細(xì)菌的形態(tài)與培養(yǎng)物進(jìn)行對照，當(dāng)培養(yǎng)與涂片結(jié)果不相符時(shí)應(yīng)重新讀片。,???,當(dāng)培養(yǎng)生長的細(xì)菌在涂片中亦和炎癥細(xì)胞相關(guān)時(shí)，報(bào)告以下兩種病原菌：肺炎鏈球菌，并報(bào)告藥敏結(jié)果流感嗜血桿菌，常規(guī)報(bào)告β-內(nèi)酰胺酶,下呼吸道標(biāo)本有意義的細(xì)菌濃度值（CFU/ml）,標(biāo)本自然咳痰誘導(dǎo)痰氣管內(nèi)吸取物支氣管肺泡灌洗液保護(hù)性毛刷支氣管灌洗液,有

27、意義的濃度 CFU/ml107不確定106104103不做培養(yǎng),,a. 定性培養(yǎng)生長的病原菌數(shù)量達(dá)到以下情況時(shí)，判斷為有臨床意義：,???,在平板第2區(qū)劃線仍大量生長，或培養(yǎng)物生長量超過1/4平板；培養(yǎng)少量生長且革蘭染色涂片可見此形態(tài)細(xì)菌與炎癥細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的病原菌；在平板劃線第1區(qū)生長且純度超過90%以上時(shí)，同時(shí)革蘭染色,涂片可見此形態(tài)細(xì)菌與炎癥細(xì)胞相

28、關(guān)的病原菌。b. 定量培養(yǎng)有臨床意義的數(shù)量：? BAL：菌落計(jì)數(shù) ≥ 104 CFU/mL? PSB：菌落計(jì)數(shù) ≥ 103 CFU/mL? 取最高稀釋度平板，分別對不同菌落形態(tài)的細(xì)菌計(jì)數(shù)，乘上稀釋倍數(shù)即為菌落數(shù)。,,當(dāng)培養(yǎng)達(dá)到5.2.3所示有臨床意義的數(shù)量時(shí)，即,使非優(yōu)勢菌也應(yīng)報(bào)告的病原菌：,a.卡他莫拉菌、腦膜炎奈瑟菌，常規(guī)報(bào)告β-內(nèi)酰胺酶；b.只對住院患者報(bào)告的病原菌有：,? 銅綠假單胞菌，并報(bào)告藥敏結(jié)果,

29、? 嗜麥芽窄食單胞菌，并報(bào)告藥敏結(jié)果,? 不動(dòng)桿菌屬，特別是鮑曼不動(dòng)桿菌，并報(bào)告藥敏結(jié)果? 洋蔥伯克霍德菌，并報(bào)告藥敏結(jié)果,,生長菌達(dá)有臨床意義數(shù)量的優(yōu)勢菌，特別當(dāng)涂片提示分離菌與,多形核白細(xì)胞相關(guān)時(shí)報(bào)告的病原菌：,a. 金黃色葡萄球菌，并報(bào)告藥敏結(jié)果,b. B群β-溶血鏈球菌（成人）、C群或G群β-溶血鏈球菌,c. 單一形態(tài)革蘭陰性桿菌（特別是肺炎克雷伯菌），并報(bào)告藥敏結(jié)果d. 苛養(yǎng)的革蘭陰性桿菌，通常報(bào)告β-內(nèi)酰胺酶e.

30、脲酶陽性的棒狀桿菌或來自ICU的患者f. 分離自免疫抑制患者的馬紅球菌,,5.3.1報(bào)告“腸桿菌科細(xì)菌”,在麥康凱平板上生長＞ 1種 G-b，經(jīng)氧化酶(-)、乳,糖產(chǎn)酸等試驗(yàn)初步鑒定為腸桿菌科細(xì)菌，報(bào)告：,經(jīng)鑒定生長“腸桿菌科細(xì)菌”。,5.3.2報(bào)告“非發(fā)酵細(xì)菌”,在麥康凱平板上生長＞ 1種 G-b，經(jīng)氧化酶(+)、,克氏雙糖鐵上不發(fā)酵葡萄糖等試驗(yàn)初步鑒定，報(bào)告：,經(jīng)鑒定生長“非發(fā)酵細(xì)菌”。,,??,若只

31、生長腸球菌屬和/或凝固酶陰性葡萄球菌（有或無酵母樣真菌），報(bào)告“革蘭陽性球菌混合生長”;若培養(yǎng)物純度達(dá)90%以上，則做初步鑒定到屬水平并分別列出。,,若未分離到致病菌，對分離的：,???????????????,草綠色鏈球菌和/或非致病奈瑟菌類白喉菌凝固酶陰性葡萄球菌羅斯菌屬（Rothia spp.)F群鏈球菌厭氧菌嗜血桿菌屬（非流感嗜血桿菌）

32、艾肯菌屬放線桿菌屬嗜二氧化碳菌莫拉菌屬腸球菌屬酵母樣真菌未達(dá)到有意義數(shù)量的金黃色葡萄球菌（如果醫(yī)院感染控制要求可做藥敏試驗(yàn)）革蘭陰性桿菌及腦膜炎奈瑟菌，均報(bào)告：“分離到口咽部正常菌群”（可列出相應(yīng)菌屬）,,如任何平板上無細(xì)菌生長，報(bào)告“無細(xì)菌生長”。出現(xiàn)此種情況可能是使用抗菌藥物抑制了正常菌群等原因。,,?????,盡管培養(yǎng)到的肺炎鏈球菌或流感嗜血

33、桿菌可能是定植菌，因而導(dǎo)致報(bào)告了假陽性結(jié)果，但通常仍在臨床報(bào)告中提示分離菌是可疑致病菌。培養(yǎng)生長的革蘭陰性桿菌或金黃色葡萄球菌是優(yōu)勢菌，且涂片也提示這些形態(tài)的細(xì)菌與感染相關(guān)時(shí)才報(bào)告。培養(yǎng)陰性時(shí)也不能排除患者的下呼吸道感染，因培養(yǎng)的陽性率低，經(jīng)常分離不到致病菌。多數(shù)醫(yī)生認(rèn)為對通氣相關(guān)肺炎和院內(nèi)感染肺炎患者做氣管吸出物或痰培養(yǎng)對臨床診斷有幫助。通常治療社區(qū)獲得性肺炎使用青霉素類抗菌藥物，如阿莫西林