胡繼紅下呼吸道感染細菌培養(yǎng)操作規(guī)范花臉稿解讀

1、,,,Standard for Bacterial Culture Proceduresof Lower Respiratory Tract Infections,主要起草人：衛(wèi)生部臨床檢驗中心 胡繼紅,? 大多數(shù)微生物室：40-60%/日? 標本是否合格？? 定植菌？致病菌？? 生長不同種類細菌如何報告？? 生長不同數(shù)量細菌取舍？? 前后兩天培養(yǎng)結果? 培養(yǎng)結果與臨床診斷,標本最多判斷難

2、報告難不符合,,,,,草綠色鏈球菌、奈瑟菌屬嗜血桿菌屬、莫拉菌屬常見引起細菌性社區(qū)感染典型肺炎病原菌：,上呼吸道正常菌群,? 肺炎鏈球菌? 流感嗜血桿菌? 金黃色葡萄球? 卡他莫拉菌,?肺炎支原體?肺炎/鸚鵡熱衣原體?嗜肺軍團菌?柯克斯體（Q熱）,痰的來源？是否被上呼吸道污染？

3、細胞內病原引起非典型肺炎：,,?????????,衛(wèi)生部臨床檢驗中心陜西省人民醫(yī)院安徽省立醫(yī)院衛(wèi)生部北京醫(yī)院北京大學人民醫(yī)院中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院解放軍總醫(yī)院浙江省溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院,胡繼紅任健康馬筱玲胡云建王輝徐英春蘇建榮羅燕萍李向陽,,1 美國微生物學會:《臨床微生物學操作手冊》（第3版）.2007.,（Clini

4、cal Microbiology Procedures Handbook）,2 美國微生物學會:《下呼吸道感染》臨床微生物學檢驗技術及操作系列叢書.2004,3 葉應嫵, 等.全國臨床檢驗操作規(guī)程(第3版). 2006,4 美國微生物學會:《臨床微生物學手冊》(第10版).20115 美國微生物學會:《臨床微生物學手冊》(第9版).2006,6 Nagendra, S., P.Bourbeau, S.Brecher, M.Dunne

5、, M.LaRocco, and G.Doern.2001.Samplingvariability in the microbiological evaluation of expectorated sputa and endotrachealaspirates. J. Clin. Microbiol.39:2344-2347.,7 Roson,B.,J.Carratala,R.verdaguer,J.Dorca,F.Manre

6、sa,and F.Gudiol.2000.Prospective study ofsputum Gram stain in the initial approach to community-acquired pneumonia requiringhospitalization.Clin.Infec.Dis.31:869-874.,8 Gleckman,R.,J.DeVita,D.Hibert,C.Pelletier,and R

7、.Martin.1988.Sputum gram stain assessment,in community-acquired bacteremic pneumonia.J.Clin.Microbiol.26:846-849.,,?,應用范圍：針對醫(yī)療機構微生物實驗室；,? 檢驗項目：常規(guī)細菌培養(yǎng)檢測下呼吸道感染病原菌；? 操作流程：按分析前、分析中和分析后的順序書寫；? 引言：是全篇的背景知識；? 三個“規(guī)范性附錄”：結果報告的

8、重要依據。? 內容——? 定性培養(yǎng)——痰/氣管吸出物；? 定量培養(yǎng)——支氣管纖維鏡采集標本；? 快速排除和鑒別——重要致病菌的方法；? QC——培養(yǎng)基和試劑的質量控制；? 細菌培養(yǎng)報告——需結合革蘭染色涂片結果；報告的臨床意義和格式內容。,（1）明確：下呼吸道標本 適合診斷的病原和檢驗項目 ；（ 2 ）規(guī)定：細菌培養(yǎng)項目需同時做革蘭染色涂片——（ 培養(yǎng) + 藥敏 + 涂片）；（ 3 ）規(guī)范：痰培養(yǎng) / 氣管吸出物

9、的 定性培養(yǎng) 程序、氣管鏡采集標本的 定量培養(yǎng) 程序；（ 4 ）明確：報告 的臨床意義和格式內容 。,分析前分析中,標本的采集、運送定性、定量培養(yǎng)、涂片流程,標本初篩、合格判斷病原菌篩查和鑒定、質量控制,分析后,染色、培養(yǎng)結果報告（致病菌、非致病菌）、結果解釋,,,???1.2.3.,人類口咽部定植：需氧菌、兼性厭氧菌和厭氧菌等微生物；菌群總數(shù)：1010 ～1012CFU

10、/mL;健康人咽部定植菌特點：菌量～最少；需氧的正常菌群組成：革蘭陽性菌為主；影響因素：人體基礎條件變化影響定植菌群的種類和數(shù)量；（微生態(tài)）,舉例：長期接觸攜帶定植菌人群菌群會變化，如日托兒童的父母的肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌（具侵襲性）定植數(shù)量會增加；,?,基礎條件變化：使用免疫抑制劑、慢性肺病、廣譜抗菌藥物治療或住院患者等人群中，革蘭陰性桿菌的優(yōu)勢明顯增加。,,,,,,常見因素：,住院患者（48h后）

11、：,?病毒感染?抗菌藥物?損害?侵入性儀器,??????,——繼發(fā)細菌感染——殺死、抑制正常菌群，使G-b、耐藥菌過度繁殖，如大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、不動桿菌、陰溝腸桿菌等；定植菌：腸道菌，MRSA，多重耐藥菌——機械通氣（ICU）嗜麥芽窄食單胞菌鮑曼不動桿菌,引起醫(yī)院獲得性感染,1）肺部感染的最常見機制：,肺泡內吸入了口咽部定植菌；,? 吸入性肺炎患者咽

12、部菌群種類： 多侵襲性細菌或耐藥細菌，如肺炎鏈球菌或革蘭陰性桿菌。,? 清除機制：,健康宿主吸入口腔定植菌后常無臨床癥狀，細菌,通常被粘液柱狀纖維清除。? 吸入能否引起肺部感染取決于： 吸入菌的致病性及數(shù)量；患者免疫系統(tǒng)；呼吸道功能等諸方面的因素。2）吸入氣溶膠肺部感染占第二位： 主因：使用了不清潔的呼吸機。,3）血液播散性肺炎占第三位：,感染通常造成雙肺下葉肺炎。由呼吸道感染引發(fā)的菌血癥占12%，因此對

13、肺部感染的高熱患者送檢血培養(yǎng)，有利于發(fā)現(xiàn)肺部感染的病原菌。,,,注1：肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌是引起兒童和老年人肺炎的最常見致病菌；卡他莫拉菌、腦膜炎球菌多發(fā),于:,基礎病患者或病毒感染后的繼發(fā)感染；金黃色葡萄球菌肺炎可引發(fā)肺膿腫；肺炎克雷伯菌大葉性肺炎常合并膿腫或肺粘連，死亡率較高。,,注2：通?？捎梅肿由飳W方法快速診斷，也可在感染后期用血清學方法檢測肺炎支原體、肺炎衣原體和軍團菌屬抗體確診。由生物恐怖病原菌，如和鼠疫耶

14、爾森菌引起的感染，血清學檢測可作為輔助診斷方法。結核分枝桿菌可用羅氏培養(yǎng)基或快速結核桿菌液體培養(yǎng)儀培養(yǎng)，或分子診斷方法檢測。,注3：暴露在特殊氣溶膠環(huán)境：與飛沫有關的結核分枝桿菌、與塵暴和鳥排泄物有關的雙相真菌等。,,??,除引起社區(qū)非典型肺炎的病原不能常規(guī)培養(yǎng)外，其他常見肺部感染的病原菌均可常規(guī)培養(yǎng)方法分離；但培養(yǎng)方法敏感性低，無法判斷分離菌的來源。,? 涂片革蘭染色方法：,????,評

15、價痰標本是否合格；提高病原菌診斷的特異性；涂片還可發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)不能生長的細菌。涂片方法提高了培養(yǎng)方法的特異性及敏感性。,,,,,4.支氣管纖維鏡標本定量培養(yǎng)的臨床意義,,,,3.1 標本采集,3.1.1 咳痰,3.1.2 氣管吸出物,注：僅當出現(xiàn)肺炎的臨床表現(xiàn)（如發(fā)熱或浸潤）時采集氣管吸出物標本，否則勿培養(yǎng)氣管吸出物，因氣管在插管 24h 后即有定植菌，培養(yǎng)結果,可能與疾病不符。,3.1.3 血培養(yǎng),注：當下呼吸道感染患者伴

16、有高熱癥狀時，送檢血培養(yǎng)（具體參考血培養(yǎng),標本采集和送檢要求）,3.1.4 誘導痰（通常不用于細菌培養(yǎng)）3.1.5 氣管鏡標本,3.1.5.1 采集氣管鏡標本注意事項3.5.1.2 支氣管肺泡灌洗液標本(BAL)3.5.1.3 保護毛刷(PSB),,3.2 標本運送注 1 ：若送檢標本超過 2h，將導致有臨床意義的致病菌數(shù)量減少，非苛養(yǎng)的口咽部定植菌過度生長。為防止口咽部正常菌群的過度生長，可將標本放置 2 ℃～ 8 ℃環(huán)境

17、，但培養(yǎng)分離到肺炎鏈球菌等苛養(yǎng)菌的機會和數(shù)量會減少。注 2 ：若標本延遲送檢超過 2h后未冷藏（超過 2h～24h， 2 ℃～ 8 ℃），應在報告中說明因延誤送檢標本，可能對培養(yǎng)結果造成的影響。,3.3,篩選并拒收下呼吸道細菌培養(yǎng)標本,??????,拒收24h內重復采集的痰細菌培養(yǎng)標本唾液鼻沖洗液和分泌物、鼻孔拭子咽部標本未經保護套管收集的支氣管刷培養(yǎng)標本痰的厭氧菌培養(yǎng)標本,注：除支氣管穿刺吸出物

18、、 PSB 、活檢標本、胸水或其他未經污染以外的標本做厭氧菌培養(yǎng)均不合格。,?,誘導痰,注：誘導痰標本只適用于檢測卡氏肺孢子菌和結核分枝桿菌，對其他病原菌檢出效果差。,,4.1 痰及氣管吸出物標本處理4.1.1 標本處理要求,???,接種標本及涂片操作必須在Ⅱ級生物安全柜中進行；應盡快處理所有標本，特別是來自急診、新入院患者和有創(chuàng)方法采集的標本（如：BAL和肺活檢標本），以保證致病菌的活性，避免造成重復采集標本；

19、使用全自動接種前處理系統(tǒng)的實驗室按廠家說明書處理標本，洗痰、液化后自動接種和涂片,革蘭染色。4.1.2 接種標本4.1.3 培養(yǎng)4.1.4 標本涂片及革蘭染色注 1 ：革蘭染色脫色時間因選用不同的脫色劑而異。 1 ） 95% 乙醇脫色時間為 30s ； 2 ） 丙酮- 乙醇（體積比為 3:7, 棕色瓶室溫保存，有效期 1 年）脫色時間 1s ～5s ，脫色效果一致性好；3 ） 丙酮 （試劑純）脫色時間最短，

20、當標本中含大量宿主細胞時脫色效果好。注 2 ：使用革蘭染色儀染色的實驗室按照廠家操作說明書進行，注意條件優(yōu)化，使涂片染色結果達到滿意效果。4.1.5顯微鏡觀察革蘭染色結果?,,4.2 氣管鏡標本處理,4.2.14.2.24.2.34.2.44.2.5,支氣管肺泡灌洗液定量培養(yǎng)保護毛刷定量培養(yǎng)接種其他培養(yǎng)基并培養(yǎng)革蘭染色標本處理剩余BAL標本可用于其他病原檢測（標本珍貴）,對剩余BAL標本離心后

21、，可根據需要進行病毒、分枝桿菌、軍團菌和真菌培養(yǎng)；或做病毒、卡氏肺孢子菌、抗酸染色和真菌涂片染色 .4.3 連續(xù)培養(yǎng)并觀察慢生長菌,,適用于檢測條件致病菌的所有項目,,只用于診斷細菌性肺炎，定量培養(yǎng)和革蘭染色,,4.4 分離并鑒定下呼吸道重要致病菌（參見附錄C）,“常見可疑菌落形態(tài)及經典快速鑒定方法(16種)”,4.4.1鏈球菌屬,4.4.2苛養(yǎng)革蘭陰性桿菌（在麥康凱平板上難生長）4.4.3革蘭陰性雙球菌,4.4.4

22、革蘭陰性桿菌（在麥康凱平板上生長良好）4.4.5葡萄球菌屬4.4.6腸球菌屬,4.4.7革蘭陽性桿菌4.4.8鑒定絲狀真菌,4.4.9涂片時可見但培養(yǎng)不生長的細菌,,,4.5質量控制,4.5.1革蘭染色4.5.2抗酸染色4.5.3培養(yǎng)基4.5.4試劑,4.5.4.1每批號、每周需做質控的試劑,4.5.4.2每批號、每次試驗需做質控的試劑,,5.1 革蘭染色報告,5.1.1痰標本報告原則（見表1）,“痰 / 氣管吸出物標

23、本涂片革蘭染色結果解釋”,5.1.2 BAL細胞離心涂片報告5.2 報告有臨床意義的微生物,5.2.1應報告的病原菌 （致病菌）,5.2.2培養(yǎng)和涂片相符合時報告的病原菌（與感染相關的定植菌）5.2.3有臨床意義的數(shù)量,5.2.4報告有臨床意義數(shù)量的非優(yōu)勢菌5.2.5報告有臨床意義數(shù)量的優(yōu)勢菌,5.3 對非致病菌的報告,5.3.1報告“腸桿菌科細菌”5.3.2報告“非發(fā)酵細菌”,5.3.3只生長腸球菌和凝固酶陰性葡萄球菌5.3

24、.4報告“分離到口咽部正常菌群”,5.4 平板上無細菌生長5.5 結果解釋,不接受培養(yǎng),可接受培養(yǎng),提示感染,特征性,提示與感染相關的病原菌,注意！,,,,用革蘭染色來評估呼吸道標本是否合格,?>10鱗狀上皮細胞/LPF——標本來自上呼吸道,彈性纖維，中性粒細胞多，鱗狀上皮細胞少，有代表性的好標本,,,,你看見多少種形態(tài)？,幾種細菌的混合形態(tài)，缺乏鱗狀上皮細胞=混合厭氧菌感,染。如果是呼吸道標本可能是吸入性肺炎。報告臨床醫(yī)

25、生“提示吸入性肺炎”,,,細胞內細菌,,,在使用抗生素之后鏈球菌常形態(tài)變得特別奇怪,,,,,呼吸道標本中未被染色的，,有折射的桿菌=抗酸桿菌,,5.2.1 應報告的病原菌,? 化膿鏈球菌,? B群β-溶血鏈球菌（兒童）,? 博德特菌屬，特別是支氣管博德特菌? 奴卡菌屬,? 新生隱球菌,? 弗朗西斯土拉菌（高致病菌）? 鼠疫耶爾森菌（高致病菌）? 炭疽芽孢桿菌（高致病菌）? 絲狀真菌（排除腐生菌污染）,,處理培養(yǎng)物應參考涂片的

26、結果，應根據革蘭染色所見炎癥細胞和細菌的形態(tài)與培養(yǎng)物進行對照，當培養(yǎng)與涂片結果不相符時應重新讀片。,???,當培養(yǎng)生長的細菌在涂片中亦和炎癥細胞相關時，報告以下兩種病原菌：肺炎鏈球菌，并報告藥敏結果流感嗜血桿菌，常規(guī)報告β-內酰胺酶,下呼吸道標本有意義的細菌濃度值（CFU/ml）,標本自然咳痰誘導痰氣管內吸取物支氣管肺泡灌洗液保護性毛刷支氣管灌洗液,有

27、意義的濃度 CFU/ml107不確定106104103不做培養(yǎng),,a. 定性培養(yǎng)生長的病原菌數(shù)量達到以下情況時，判斷為有臨床意義：,???,在平板第2區(qū)劃線仍大量生長，或培養(yǎng)物生長量超過1/4平板；培養(yǎng)少量生長且革蘭染色涂片可見此形態(tài)細菌與炎癥細胞相關聯(lián)的病原菌；在平板劃線第1區(qū)生長且純度超過90%以上時，同時革蘭染色,涂片可見此形態(tài)細菌與炎癥細胞相

28、關的病原菌。b. 定量培養(yǎng)有臨床意義的數(shù)量：? BAL：菌落計數(shù) ≥ 104 CFU/mL? PSB：菌落計數(shù) ≥ 103 CFU/mL? 取最高稀釋度平板，分別對不同菌落形態(tài)的細菌計數(shù)，乘上稀釋倍數(shù)即為菌落數(shù)。,,當培養(yǎng)達到5.2.3所示有臨床意義的數(shù)量時，即,使非優(yōu)勢菌也應報告的病原菌：,a.卡他莫拉菌、腦膜炎奈瑟菌，常規(guī)報告β-內酰胺酶；b.只對住院患者報告的病原菌有：,? 銅綠假單胞菌，并報告藥敏結果,

29、? 嗜麥芽窄食單胞菌，并報告藥敏結果,? 不動桿菌屬，特別是鮑曼不動桿菌，并報告藥敏結果? 洋蔥伯克霍德菌，并報告藥敏結果,,生長菌達有臨床意義數(shù)量的優(yōu)勢菌，特別當涂片提示分離菌與,多形核白細胞相關時報告的病原菌：,a. 金黃色葡萄球菌，并報告藥敏結果,b. B群β-溶血鏈球菌（成人）、C群或G群β-溶血鏈球菌,c. 單一形態(tài)革蘭陰性桿菌（特別是肺炎克雷伯菌），并報告藥敏結果d. 苛養(yǎng)的革蘭陰性桿菌，通常報告β-內酰胺酶e.

30、脲酶陽性的棒狀桿菌或來自ICU的患者f. 分離自免疫抑制患者的馬紅球菌,,5.3.1報告“腸桿菌科細菌”,在麥康凱平板上生長＞ 1種 G-b，經氧化酶(-)、乳,糖產酸等試驗初步鑒定為腸桿菌科細菌，報告：,經鑒定生長“腸桿菌科細菌”。,5.3.2報告“非發(fā)酵細菌”,在麥康凱平板上生長＞ 1種 G-b，經氧化酶(+)、,克氏雙糖鐵上不發(fā)酵葡萄糖等試驗初步鑒定，報告：,經鑒定生長“非發(fā)酵細菌”。,,??,若只

31、生長腸球菌屬和/或凝固酶陰性葡萄球菌（有或無酵母樣真菌），報告“革蘭陽性球菌混合生長”;若培養(yǎng)物純度達90%以上，則做初步鑒定到屬水平并分別列出。,,若未分離到致病菌，對分離的：,???????????????,草綠色鏈球菌和/或非致病奈瑟菌類白喉菌凝固酶陰性葡萄球菌羅斯菌屬（Rothia spp.)F群鏈球菌厭氧菌嗜血桿菌屬（非流感嗜血桿菌）

32、艾肯菌屬放線桿菌屬嗜二氧化碳菌莫拉菌屬腸球菌屬酵母樣真菌未達到有意義數(shù)量的金黃色葡萄球菌（如果醫(yī)院感染控制要求可做藥敏試驗）革蘭陰性桿菌及腦膜炎奈瑟菌，均報告：“分離到口咽部正常菌群”（可列出相應菌屬）,,如任何平板上無細菌生長，報告“無細菌生長”。出現(xiàn)此種情況可能是使用抗菌藥物抑制了正常菌群等原因。,,?????,盡管培養(yǎng)到的肺炎鏈球菌或流感嗜血

33、桿菌可能是定植菌，因而導致報告了假陽性結果，但通常仍在臨床報告中提示分離菌是可疑致病菌。培養(yǎng)生長的革蘭陰性桿菌或金黃色葡萄球菌是優(yōu)勢菌，且涂片也提示這些形態(tài)的細菌與感染相關時才報告。培養(yǎng)陰性時也不能排除患者的下呼吸道感染，因培養(yǎng)的陽性率低，經常分離不到致病菌。多數(shù)醫(yī)生認為對通氣相關肺炎和院內感染肺炎患者做氣管吸出物或痰培養(yǎng)對臨床診斷有幫助。通常治療社區(qū)獲得性肺炎使用青霉素類抗菌藥物，如阿莫西林