蛋白質組學技術及其在低劑量輻射生物效應中的應用

1、蛋白質組學技術及其在低劑量輻射生物效應中的應用,主要內容,20世紀三大科學計劃：曼哈頓原子彈研制計劃、阿波羅登月計劃、人類基因組計劃(HGP)HGP是由美國學者1985年在美國能源部的一次會議上討論，并由諾貝爾獎獲得者Renato Dulbecco 于1986年在Science 雜志發(fā)表的一篇文章中提出的.其目的是闡明人類基因組30億個堿基對的序列，發(fā)現所有人類基因并闡明其在染色體上的位置，從而在整體上破譯人類遺傳信息。該計劃啟動

2、于1990年，原定15年完成，由于技術的成熟與基因組測序的規(guī)模化運作，以及來自商業(yè)競爭方面的壓力，2000年6月26日基因組序列草圖測序完成。,人類基因組以及多種模式生物、重要生物基因組全序列的完成，標志著生命科學研究進入所謂的“后基因組時代 (Postgenome era)”, 即產生了功能基因組學（Functional Genomics）,結構基因組學：以全基因組測序為目標；“靜態(tài)的”功能基因組學：以基因功能鑒定為目標，又稱

3、后基因組研究；“動態(tài)的”,轉錄組學蛋白質組學代謝組學表型組學相互作用組 ……,功能基因組學,,蛋白質組(proteome) PROTEOME = PROTEin +genOME 最早是由澳大利亞學者Wilkins和Williams等人于1994年提出，并首次公開發(fā)表在1995年7月的Electrophoresis雜志上，指的是由一個細胞、一個組織或是一種生物的基因組所表達的全部相應的蛋白質。 蛋白質

4、組學（Proteomics） 指應用各種技術手段來研究蛋白質組的一門新興科學，其目的是從整體的角度分析細胞或組織內動態(tài)變化的蛋白質組成成份、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質之間的相互作用與聯系，揭示蛋白質功能與細胞生命活動規(guī)律。,蛋白質組與基因組相對應，也是一個整體的概念，是基因組表達的全部蛋白。但兩者又有根本的不同之處 基因組是靜態(tài)的，一個有機體從它的發(fā)生、發(fā)展到衰老、死亡，不同細胞、組織和器官的基因組是基本穩(wěn)定不

5、變。蛋白質組作為基因組表達的產物隨時間、地點、環(huán)境等條件變化，是一個動態(tài)的概念。 在人類基因組計劃中大約有30,000個基因被鑒定出來。一個基因=平均4個左右的剪接變異體，約120,000或更多的獨立蛋白。翻譯后修飾和蛋白相互作用，蛋白質組比基因組復雜10倍以上。,蛋白質組學與基因組學的聯系與區(qū)別,Proteomics,生理病理過程的復雜性,,研究技術的高通量性,人類蛋白質組正式啟動,2001年成立國際人類蛋白質組組織（HUPO），2

6、003.12.15啟動兩個首批行動計劃， 2003成立了中國人類蛋白質組組織（CHHUPO）人類肝臟蛋白質組計劃（HLPP）由中國軍事醫(yī)學科學院副院長賀福初院士領導，16國80多個實驗室參加。中國第一次領導重大國際協作計劃。人類血漿蛋白質組計劃（HPPP）由美國科學家牽頭，13國47個實驗室參加。,蛋白質組學的研究內容,在蛋白質水平上定量、動態(tài)、整體地研究生物體，它旨在闡明生物體全部蛋白質的表達模式及功能模式。 1）組成（表

7、達）蛋白質組學—了解某種特定的細胞、組織或器官制造的蛋白質種類；蛋白質表達譜（組織、器官、細胞、亞細胞分布等） 2）比較蛋白質組學—尋找正常組織與異常組織蛋白表達差異 3）結構蛋白質組學—描繪蛋白質的精確三維結構，揭示其結構上的關鍵部位，如與藥物結合并且決定其活性的部位。 4）功能蛋白質組學—蛋白質的功能和相互作用；明確各種蛋白質分子是如何形成類似于電路的網絡； 5）蛋白質組學研究的技術平臺與生物

8、信息學—分離、鑒定技術，分析軟件和數據庫。,蛋白質組學的研究技術,蛋白質分離技術基于凝膠系統(tǒng)的分離技術——雙向凝膠電泳基于非凝膠系統(tǒng)的分離技術——HPLC；毛細管電泳 蛋白質鑒定技術 Edman 測序 質譜技術；生物信息學技術 蛋白質數據庫；相互作用研究技術 酵母雙雜交技術 免疫共沉淀等,蛋白質分離技術雙向凝膠電泳基本原理：第一向為等電聚焦(Isoelectro focusing, IEF)，根據蛋白的等電點不

9、同進行分離；第二向為SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，按亞基分子量大小進行分離優(yōu)點：較高的分辨率，可同時分離上萬種蛋白質缺點：不適用于檢測低豐度蛋白、疏水性及強酸強堿性蛋白；尚不能完全自動化，消耗時間長。,Spot Excision,雙向電泳流程,凝膠的圖像處理分析和膠內酶切,凝膠圖像的掃描：圖像加工：斑點檢測和定量：凝膠配比：數據分析：數據呈遞和解釋：2-DE數據庫的建立：,圖像掃描和分析——Image

10、Scanner II,全自動斑點切取系統(tǒng)（Ettan Spot Picker）,,蛋白質鑒定技術Edman 降解優(yōu)點：測定肽序列，非常準確缺點：成本高、測序速度較慢、靈敏度低，不適合鑒定數以百計的蛋白質 質譜法原理：通過電離源將蛋白質分子轉化為氣相離子，然后利用質譜分析儀的電場、磁場將具有特定質量與電荷比值(M/Z 值)的蛋白質離子分離開來，經過離子檢測器收集分離的離子，確定離子的M/Z 值，分析鑒定未知蛋白質。,質譜分析的特

11、點,,,,主要可以分為三種方法,質譜分析方法,串聯質譜序列分析,串聯質譜（Tandem-MS）,第一級質譜得到肽的分子離子,選取目標肽的離子作為母離子，與惰性氣體碰撞，使肽鏈中的肽鍵斷裂，形成一系列離子，即N端碎片離子系列（B系列）和C端碎片離子系列（Y系列），將這些碎片離子系列綜合分析，可得出肽段的氨基酸序列?！皃rotein ladder sequencing”的方法，通過對Edman降解法的修改，產生一系列截去N端殘基的肽段，用

12、MALDI-MS測得這些肽段的質量，從而推測N端序列。,,生物信息學技術,通過質譜所獲得的鑒定結果通常都是高通量且比較復雜的，分析這些數據必須要通過自動化的方式對其進行識別、比較和分析。 生物信息學（Bioinformatics）就是通過計算機以及信息理論對獲得的蛋白質、核酸序列等大量的生物信息進行采集、處理、存儲、分析及解釋，并結合統(tǒng)計學、計算機和生物醫(yī)學等來獲得其具有的各種生物學功能的一門新興的邊緣學科。 借助生物信息

13、學分析能夠進一步了解和分析被測蛋白的種類、屬性、結構、生物功能及其同源蛋白。,蛋白序列數據庫SWISS-PROT/TrEMBL；http://www.expasy.ch）基因序列數據庫Genbank，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ EMBL， http://www.ebi.ac.uk/）蛋白模式數據庫Prosite；http://www.expasy.ch/sprot/prosite.html）蛋

14、白質二維凝膠電泳數據庫、蛋白三維結構數據庫PDB，http://www.pdb.bnl.gov/；FSSP，http://www.embl-ebi.ac.uk）蛋白翻譯后修飾數據庫OGLYCBASE，http://www.cbs.dtu.dk/databases/ OGLYCBASE）,蛋白質組學研究相關數據庫,蛋白相互作用研究技術研究蛋白質間的相互作用的常用方法：酵母雙雜交系統(tǒng)親和層析免疫沉淀蛋白質交聯 酵

15、母雙雜交系統(tǒng)是當前發(fā)展迅速、應用廣泛的主要方法。,轉錄激活因子轉錄激活因子在結構上是組件式的(modular),即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結構域構成,其中有DNA結合結構域(DNA binding domain,簡稱為DB)和轉錄激活結構域(activation domain,簡稱為AD),它們是轉錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。單獨的DB雖然能和啟動子結合,但是不能激活轉錄。,酵母雙雜交系統(tǒng)的建立與發(fā)展,報告基因,DB與

16、AD分離，不轉錄,DB與AD結合，激活轉錄,雙雜交的原理兩個等測蛋白質1和2, 前者與酵母菌轉錄激活因子Gal4的DB結合, 另一個與Gal4的AD結合。,由DB和AD形成的融合蛋白現在一般分別稱之為“誘餌”(bait)和“獵物”(fish)。,HIS基因表達,,早期抑制糖分解及丙酮酸脫氫酶晚期影響脂代謝，促進炎癥反應,小鼠出生第十天七個月后處死主要涉及通路：代謝、炎癥反應和細胞骨架通路,蛋白質組學實驗室所需的條件,Thank