基質輔助激光解析離子化研究及其在蛋白質組學中的應用.pdf

1、本論文以基質輔助激光解析離子化(MALDI)技術為主要研究對象,通過對該技術光電化學原理的探討,發(fā)展了一系列基于半導體材料基底的離子源內氧化還原反應,并將這些反應用于蛋白質組學的研究。此外,基于MALDI技術,本論文還研究了磷酸化肽段的MALDI靶板原位富集分析以及蛋白質在介孔材料內的快速酶解鑒定。
　　 論文的第一章概述了生物質譜技術和蛋白質組學近年來的研究熱點和難點。包括基質輔助激光解析離子化原理研究、無機光敏基底輔助的激光

2、誘導樣品離子化、納米氧化鈦等無機半導體材料的光電化學性質、基于質譜的各種樣品碎裂技術、肽段標記技術、蛋白質組學后修飾研究以及固定化酶技術用于蛋白快速酶解。
　　 本論文研究工作分為三章,基于激光解析離子化(LDI)技術的光電原理,發(fā)展了一系列由半導體材料納米氧化鈦誘發(fā)的源內氧化還原反應,用于肽段的在線標記、二硫鍵的在線還原以及肽段的源內氧化a,x裂解;以蛋白質后修飾為研究對象,發(fā)展了磷酸化肽段的MALDI靶板原位富集和分析;以蛋

3、白質快速結構分析為目標,發(fā)展了基于介孔材料納米限域效應的蛋白質高效酶解鑒定。具體內容如下:
　　 (一)激光解析離子化過程的源內光電化學反應研究及其應用
　　 在第二章中,我們設計研制了納米氧化鈦修飾的MALDI靶板。通過將納米氧化鈦粒子沉積在一塊不銹鋼靶板上形成陣列式的靶點,再將這些點在高溫下燒結,就可以得到一系列具有光敏性能的靶點。這些靶點可以作為多孔的基底用于沉積樣品。在激光解析(LDI)離子化過程中,這些基底中能

4、夠形成大量的氧化還原中心用于誘發(fā)各種各樣的源內反應。此外由于這些靶點由納米粒子構成,具有很大的比表面積,因而具有很強的光致氧化還原能力。利用這一原理,我們先后進行了在線的半胱氨酸氧化標記反應、肽段氧化裂解反應以及二硫鍵的還原斷裂反應。
　　 1.基于基質輔助激光解析離子化過程光電化學原理的半胱氨酸源內標記
　　 在本節(jié)中,對苯二酚作為一個氧化還原介體被加入到樣品中。在激光的作用下,光致產(chǎn)生的氧化性空穴可以將對苯二酚氧化成

5、對苯醌,之后對苯醌可以與半胱氨酸的巰基發(fā)生加成反應從而達到半胱氨酸的標記,標記后得肽段可以與未標記的樣品一起進入質量分析器得到檢測,通過在質譜圖上查找具有對苯醌分子量加成的一對峰就可以得到關于肽段內半胱氨酸含量的信息。通過選擇性的在線標記半胱氨酸,可以快速的將目標肽段從混合樣品中分析出來,該方法還可用于在線的計數(shù)某一肽段中半胱氨酸的數(shù)目。在數(shù)據(jù)庫的檢索過程中,如果只提供分子量這一個信息,則必須達到精確度很高的質譜檢測核質比才能夠得到較為

6、精確的檢索結果。通過附加其他有意義的信息,可以大大的提高數(shù)據(jù)檢索的置信度。利用這種源內的半胱氨酸氧化標記,可以在得到目標肽段核質比的同時也得到該肽段內半胱氨酸的含量信息,通過附加這種信息,樣品鑒定的得分可以被極大地提高。并以beta乳球蛋白和牛血清白蛋白以及蛋白混合物為例,對這些原理加以論證。
　　 2.基于激光解析離子化過程中光催化還原反應用于二硫鍵源內斷裂
　　 通常情況下認為半導體納米氧化鈦在激光輻射下主要會體現(xiàn)很

7、強的氧化性,價帶空穴所體現(xiàn)的氧化能力比導帶電子的還原能力要強很多,因此長期以來關于光催化還原反應的研究相對很少。通過添加各種電子給體,可以大大抑制光生電子在材料內部和表面的淬滅,從而提高體系的還原性。通過添加電子給體葡萄糖,首次實現(xiàn)了無有機基質激光解析離子化(LDI)源內的光催化還原反應。我們以二硫鍵的還原為例說明了這種源內還原反應。二硫鍵的形成對于穩(wěn)定蛋白質的三維結構具有很重要的意義,為了實現(xiàn)蛋白結構的分析必須通過還原反應打開二硫鍵。

8、傳統(tǒng)的二硫鍵還原反應主要是在溶液相中進行,最近,田中耕一報道了一種新穎的還原性基質,1,5-二胺基萘,并將該基質用于實現(xiàn)源內的二硫鍵還原。這里我們利用半導體氧化鈦和葡萄糖提供了一種類似的還原環(huán)境用于二硫鍵斷裂。以人胰島素為例,對這種源內還原作用進行了論述。
　　 3.基于激光解析離子化過程光電化學原理的肽段源內氧化還原裂解
　　 在本節(jié)中,激光解析離子化過程中的光電化學原理被用于源內的肽段裂解。采用前述的方法,樣品肽段和

9、葡萄糖一起被點在納米氧化鈦組成的基底上。在激光的輻射下,電子從價帶躍遷到導帶,并且產(chǎn)生具有氧化能力的空穴和具有還原能力的自由電子,從而進一步引發(fā)后續(xù)的氧化還原反應。葡萄糖在這里既是電子給體也是空穴導體,因而可以實現(xiàn)遠程的發(fā)生在尾焰中的樣品氧化和肽段裂解。在這里,我們觀測到了強烈的Cα-C鍵斷裂,同時N-Cα鍵的斷裂有時也能被觀察到。前者主要產(chǎn)生a,x碎片離子,后者則主要產(chǎn)生c,z碎片離子。我們認為Cα-C鍵的斷裂是由空穴氧化引起的,這一

10、氧化過程具體來說有可能是通過電子或者自由基傳遞的形式完成的;而N-Cα鍵的斷裂則是一個還原過程,與通常報道的ISD或者ECD過程原理相似。
　　 (二)納米氧化鈦修飾的功能化MALDI靶板用于原位磷酸化肽段富集
　　 在本章中,發(fā)展了一種MALDI靶上的磷酸化肽段富集分析方法。將TiO2納米粒子修飾在一塊不銹鋼靶板上,就可以形成陣列狀的具有極大比表面積和功能化的靶點。這些靶點被用來從肽段混合物中選擇性的富集磷酸化肽段,之

11、后就可以直接對這些固定在靶點上的磷酸化肽段進行MALDI-MS分析。Beta-酪蛋白和蛋白混合物被作為樣品分析該方法的選擇性和靈敏度。在這種靶上的富集方法中,磷酸化肽段的捕獲、純化和后續(xù)的質譜分析都是在一塊靶板上完成的,這樣就大大地避免了樣品的流失并簡化了分析步驟。由于具有很高的選擇性和很低的檢測限,該靶上富集方法可能用于磷酸化肽段的在線檢測分析,這對于高通量的蛋白質學研究有著重要的意義。更進一步的,我們還通過印刷的方式把TiO2修飾在

12、了鋁箔上,然后把修飾好的鋁箔負載在MALDI靶板的表面,從而避免了對靶板本身的修飾和再清潔。該鋁箔可以被一次性使用和大量重復生產(chǎn),因而使得該靶上富集方法有著更大的應用前景。
　　 (三)基于介孔材料納米限域的快速蛋白酶解
　　 在本章中,發(fā)展了基于功能化介孔材料CNS的納米酶反應器用于解決傳統(tǒng)溶液蛋白酶解動力學過程慢的問題。具有18nm平均孔徑的腈基修飾介孔氧化硅被證實為一個很好的胰蛋白酶的載體。肌血球蛋白和細胞色素C的

13、快速酶解被作為實例證實該方法的可行性。此外,該酶反應器還被用于生物實際樣品人肝細胞質蛋白質組的研究,展示了很好的效果?；|輔助激光解析時間飛行質譜被用來分析酶解產(chǎn)生的肽段。實驗結果表明這種基于CNS胰蛋白酶納米反應器的酶解比傳統(tǒng)溶液酶解速率要快很多,這一加速效應可以歸結為一種納米尺度的限域作用以及底物、酶的局部濃度富集作用。通過二十分鐘的納米限域酶解,我們成功的鑒定了濃度只有2ng/μl的蛋白。該酶反應器還被進一步用于酶解人肝細胞質生物