抗體芯片基本技術平臺的建立及其在肝臟蛋白質組學研究中的應用.pdf

1、隨著人類基因組計劃的基本完成，以功能基因組學和蛋白質組學為主要研究內容的后基因組時代來臨?；蚴沁z傳物質的載體，蛋白質才是生理功能的執(zhí)行者。因此對基因組的研究有時并不能完全反映機體功能的變化，為了減少這種相對“誤差”，迫切需要一種快捷，有效的蛋白質分析技術。蛋白質芯片技術應運而生。蛋白芯片(proteinchip)是按預先設計的方式將抗原或抗體固定在玻片上，形成蛋白質的微陣列，即蛋白質芯片，帶有特殊標記的蛋白質分子(抗體或抗原)與之特異

2、性結合，通過對標記物的檢測來實現(xiàn)抗原抗體的高通量互檢。該技術所需蛋白質的量極少，檢測反應相對較快，具有通量化，穩(wěn)定性較好，靈敏度較高。目前在國內外這方面的研究都才剛剛起步。蛋白質芯片以蛋白質代替DNA作為檢測目的物，比基因芯片更接近生命活動的物質層面，因而有著比基因芯片更加直接的應用前景。蛋白質芯片作為檢測蛋白質存在和運動變化的高效工具，必將發(fā)揮越來越大的作用。 因本課題是國家科技攻關計劃項目“人類肝臟蛋白抗體庫的構建與應用”中

3、的子項目，其主要研究任務是：利用獲得的單克隆抗體研制適合肝臟蛋白表達譜和功能研究的抗體芯片，探索提高標記效率和芯片敏感性的方法，研制成肝臟蛋白抗體芯片和配套試劑，并應用于肝臟蛋白質的定性、定量和相互作用等研究。我們在經過文獻檢索之后，選擇了一個基于環(huán)氧基表面修飾玻片的抗原-抗體結合反應體系，對在這一體系中抗原/抗體的固定方法、抗原-抗體特異性結合反應、蛋白質的標記方法及信號檢測等問題進行研究，并嘗試將這一體系應用于肝臟蛋白質組學的研究。

4、得到以下實驗結果： 1.預點樣10個拷貝點后，各蛋白質樣品的熒光測量值趨于穩(wěn)定，可正式點樣。 2.點樣后的固定時間以24-48h為宜。時間過長或過短均會導致熒光測量值偏低。 3.使用乙醇胺封閉緩沖液的封閉效果最好。最佳的抗原-抗體特異性結合反應溫度為37℃、時間為2h，選擇1mg/ml作為最佳的點樣濃度。 4.當點樣濃度一定時，靶分子濃度增加，熒光信號強度也相應增加，且靶分子濃度在1ng/ml～1ug/m

5、l范圍內與熒光強度間有線性關系。 5.應用建立的抗體芯片技術平臺，對人的四種肝臟總蛋白(成肝胞漿蛋白、胎肝核蛋白、成肝勻漿蛋白、胎肝線粒體蛋白)進行了檢測分析，制備了含32種單克隆抗體，共432點的抗體微陣列，初步進行了肝臟蛋白質組的研究分析。得到以下初步結論：CBR在胎肝線粒體蛋白中表達豐度較高，成肝胞漿蛋白中豐度最低。DCXR在成肝胞漿蛋白中表達豐度較高。ALB在同一發(fā)育期的不同樣本(胎肝或成肝)中表達趨于穩(wěn)定，但在胎肝中的

6、表達量高于成人肝。TF在成肝勻漿蛋白中的含量最高。A2M在成肝勻漿蛋白中的含量最高，成肝胞漿蛋白中的含量最低。 6.探索了量子點熒光標記蛋白質的新方法。用NHS對量子點進行功能化，經修飾的量子點可以與蛋白共價偶聯(lián)。將功能化量子點標記蛋白用于抗體芯片的檢測，初步實驗證明功能化量子點可以應用于生物芯片檢測的領域。 7.出于研制可目視化檢測芯片的需求，又探索了把金磁微粒作為標記試劑標記蛋白質。經標記的蛋白質用于抗體芯片檢測，可