抗體芯片基本技術(shù)平臺的建立及其在肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用.pdf

1、隨著人類基因組計(jì)劃的基本完成，以功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)為主要研究內(nèi)容的后基因組時(shí)代來臨?；蚴沁z傳物質(zhì)的載體，蛋白質(zhì)才是生理功能的執(zhí)行者。因此對基因組的研究有時(shí)并不能完全反映機(jī)體功能的變化，為了減少這種相對“誤差”，迫切需要一種快捷，有效的蛋白質(zhì)分析技術(shù)。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。蛋白芯片(proteinchip)是按預(yù)先設(shè)計(jì)的方式將抗原或抗體固定在玻片上，形成蛋白質(zhì)的微陣列，即蛋白質(zhì)芯片，帶有特殊標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子(抗體或抗原)與之特異

2、性結(jié)合，通過對標(biāo)記物的檢測來實(shí)現(xiàn)抗原抗體的高通量互檢。該技術(shù)所需蛋白質(zhì)的量極少，檢測反應(yīng)相對較快，具有通量化，穩(wěn)定性較好，靈敏度較高。目前在國內(nèi)外這方面的研究都才剛剛起步。蛋白質(zhì)芯片以蛋白質(zhì)代替DNA作為檢測目的物，比基因芯片更接近生命活動的物質(zhì)層面，因而有著比基因芯片更加直接的應(yīng)用前景。蛋白質(zhì)芯片作為檢測蛋白質(zhì)存在和運(yùn)動變化的高效工具，必將發(fā)揮越來越大的作用。 因本課題是國家科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目“人類肝臟蛋白抗體庫的構(gòu)建與應(yīng)用”中

3、的子項(xiàng)目，其主要研究任務(wù)是：利用獲得的單克隆抗體研制適合肝臟蛋白表達(dá)譜和功能研究的抗體芯片，探索提高標(biāo)記效率和芯片敏感性的方法，研制成肝臟蛋白抗體芯片和配套試劑，并應(yīng)用于肝臟蛋白質(zhì)的定性、定量和相互作用等研究。我們在經(jīng)過文獻(xiàn)檢索之后，選擇了一個(gè)基于環(huán)氧基表面修飾玻片的抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)體系，對在這一體系中抗原/抗體的固定方法、抗原-抗體特異性結(jié)合反應(yīng)、蛋白質(zhì)的標(biāo)記方法及信號檢測等問題進(jìn)行研究，并嘗試將這一體系應(yīng)用于肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。

4、得到以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.預(yù)點(diǎn)樣10個(gè)拷貝點(diǎn)后，各蛋白質(zhì)樣品的熒光測量值趨于穩(wěn)定，可正式點(diǎn)樣。 2.點(diǎn)樣后的固定時(shí)間以24-48h為宜。時(shí)間過長或過短均會導(dǎo)致熒光測量值偏低。 3.使用乙醇胺封閉緩沖液的封閉效果最好。最佳的抗原-抗體特異性結(jié)合反應(yīng)溫度為37℃、時(shí)間為2h，選擇1mg/ml作為最佳的點(diǎn)樣濃度。 4.當(dāng)點(diǎn)樣濃度一定時(shí)，靶分子濃度增加，熒光信號強(qiáng)度也相應(yīng)增加，且靶分子濃度在1ng/ml～1ug/m

5、l范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度間有線性關(guān)系。 5.應(yīng)用建立的抗體芯片技術(shù)平臺，對人的四種肝臟總蛋白(成肝胞漿蛋白、胎肝核蛋白、成肝勻漿蛋白、胎肝線粒體蛋白)進(jìn)行了檢測分析，制備了含32種單克隆抗體，共432點(diǎn)的抗體微陣列，初步進(jìn)行了肝臟蛋白質(zhì)組的研究分析。得到以下初步結(jié)論：CBR在胎肝線粒體蛋白中表達(dá)豐度較高，成肝胞漿蛋白中豐度最低。DCXR在成肝胞漿蛋白中表達(dá)豐度較高。ALB在同一發(fā)育期的不同樣本(胎肝或成肝)中表達(dá)趨于穩(wěn)定，但在胎肝中的

6、表達(dá)量高于成人肝。TF在成肝勻漿蛋白中的含量最高。A2M在成肝勻漿蛋白中的含量最高，成肝胞漿蛋白中的含量最低。 6.探索了量子點(diǎn)熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)的新方法。用NHS對量子點(diǎn)進(jìn)行功能化，經(jīng)修飾的量子點(diǎn)可以與蛋白共價(jià)偶聯(lián)。將功能化量子點(diǎn)標(biāo)記蛋白用于抗體芯片的檢測，初步實(shí)驗(yàn)證明功能化量子點(diǎn)可以應(yīng)用于生物芯片檢測的領(lǐng)域。 7.出于研制可目視化檢測芯片的需求，又探索了把金磁微粒作為標(biāo)記試劑標(biāo)記蛋白質(zhì)。經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)用于抗體芯片檢測，可