幻燈片2

1、AKP (堿性磷酸酶)的Km測(cè)定——Lineweaver-Burk equation(Hanes-Wolff plot、Eadie-Hofstee plot),目的要求,1、學(xué)習(xí)了解米氏常數(shù)的意義2、米氏常數(shù)測(cè)定的原理3、米氏常數(shù)的作圖4、堿性磷酸酶活性測(cè)定的原理和方法,酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)： 底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響,1913年 The Michaelis – Menten Equation,學(xué)習(xí)了解米

2、氏常數(shù)的意義,Km：米氏常數(shù)，是研究酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)最重要的常數(shù)。物理意義： Km值等于酶反應(yīng)速度為最大速度一半時(shí)的底物濃度。 Km值是酶的特征性常數(shù)，只與酶的性質(zhì)有關(guān),其單位為摩爾濃度 。 Km反映酶和底物的親和力，Km 值大與底物親和力愈小。 Km與底物濃度和酶濃度無(wú)關(guān)，而受溫度和pH值的影響,應(yīng)用： （1）鑒定酶 （2）判斷酶的最佳底物：最小Km （3）計(jì)算不同底物濃度時(shí)酶促反應(yīng)速度相當(dāng)于最大

3、反應(yīng)速度的比率 （4）測(cè)定不同抑制劑對(duì)Km的影響,米氏常數(shù)測(cè)定的原理,在溫度、pH和酶濃度一定時(shí)，酶促反應(yīng)初速度與底物濃度的關(guān)系滿足米-曼氏方程式 ，Km是酶的特征性常數(shù)，反映了酶與特定底物的親和力大小。Lineweaver 和 Burk 將米氏方程改寫(xiě)成雙倒數(shù)形式推導(dǎo)米-曼氏方程式可得一直線方程在橫坐標(biāo)上的截距即可算出Km值。 實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇不同的[S]，測(cè)定相對(duì)應(yīng)的V。求出兩者的倒數(shù)，以1/V

4、對(duì)1/[S]作圖，則得到一斜率為“Km/Vmax”的直線，在縱軸上的截距為“1/Vmax” 。將直線外推與橫軸相交，其橫軸截距為“-1/Km”。,,Km的測(cè)定： Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法,實(shí)驗(yàn)方法：磷酸苯二鈉法,實(shí)驗(yàn)以AKP為目標(biāo)，選擇不同濃度的磷酸苯二鈉為AKP的底物，磷酸苯二鈉被AKP水解，生成酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4-氨基安替比林作用下，經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌的衍生物，根據(jù)紅色的深淺可測(cè)出酶活

5、力的強(qiáng)弱,實(shí)驗(yàn)步驟,1.分A、B組，各取試管8支編號(hào)， A組稀釋10mmol/L底物液， B組吸取相應(yīng)的已稀釋底物液 1.0ml ，各加入pH 10的碳酸鈉緩沖液0.9ml ，混勻。,2.再加AKP 0.1ml ，混勻后立即放入37℃水浴15min 。 3.各加入0.5mol/L NaOH 1.0ml，終止反應(yīng)，混勻。 4.各管中依次加入0.3％ 4-氨基安替比林1.0ml和0.5％鐵氰化鉀2.0ml充分混勻，室溫放置10m

6、in以第一管為對(duì)照，波長(zhǎng)510nm比色。,實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄與分析,數(shù)值計(jì)算和作圖：以1/ [S]為橫坐標(biāo)，1/A510nm為縱坐標(biāo)，在方格紙上描點(diǎn)作圖，并計(jì)算Km值。,-1/Km = -0.27 ， Km =3.70mmol/L,嚴(yán)格反映初速度條件 控制反應(yīng)時(shí)間，足夠底物濃度控制其它對(duì)酶促反應(yīng)速度有影響的因素 最適酶濃度、最適pH、最適溫度、不能有抑制劑,注意事項(xiàng),思考題,預(yù)習(xí)： P111

7、,DNA的提取和純化中所用各試劑的作用。DNA的純度要求、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)。,Km的定義，測(cè)定AKP的Km時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)的哪些條件要加以控制？,,分光光度法是根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜及光的吸收定律，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析的一種方法。 紅外吸收光譜：800nm?50?m 。 主要用于有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)鑒定。 紫外吸收光譜：200?400 nm（近紫外區(qū)）,無(wú)色物質(zhì)。 可用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。 可見(jiàn)光：400~700nm,有色物質(zhì)溶

8、液,概 念,電磁波譜: 以波長(zhǎng)大小順序排列的電磁波譜圖,可 見(jiàn) 光,,,物質(zhì)對(duì)光的吸收具有選擇性，若溶液選擇性地吸收了某種顏色的光，則溶液呈吸收光的互補(bǔ)光。,表1 物質(zhì)的顏色與吸收光顏色的互補(bǔ)關(guān)系,Lamber-Beer定律-分光光度法理論基礎(chǔ),Lamber-Beer定律的物理表示式： A=KCL含義：當(dāng)一束單色光通過(guò)溶液介質(zhì)后，光能被吸收一部分，吸收多少與溶液的濃度和厚度成正比。,L

9、amber-Beer定律應(yīng)用,定性分析：與已知物質(zhì)吸收光譜相比較，特征值→定性依據(jù)（1）比較廣譜的一致性：吸收峰位置、數(shù)目、強(qiáng)度、形狀。（2）比較λmax或ε的一致性。（3）比較吸光度比值：OD260nm/280nm定量分析：使用分光光度法測(cè)定溶液某物質(zhì)的濃度（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法（2）標(biāo)準(zhǔn)管法（3）摩爾吸光系數(shù)法,標(biāo)準(zhǔn)曲線法,取標(biāo)準(zhǔn)品配制成一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（5個(gè)以上），在最適波長(zhǎng)處（通常為λmax ），用同樣厚度的吸收

10、池分別測(cè)定其吸光度，作圖，以A值為縱坐標(biāo)，C值為橫坐標(biāo)，得一通過(guò)坐標(biāo)原點(diǎn)的直線——標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將被測(cè)溶液置于吸收池中，在相同條件下，測(cè)量其吸光度，根據(jù)吸光度即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得其對(duì)應(yīng)的含量。使用時(shí)要注意標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)溶液在相同條件下進(jìn)行測(cè)量，且溶液的濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。,,理想標(biāo)準(zhǔn)曲線：一條斜率接近1且通過(guò)原點(diǎn)的直線。標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度應(yīng)在被測(cè)物質(zhì)濃度的一半到兩倍之間，吸光度：0.05—1.0，至少五個(gè)點(diǎn)。,標(biāo)準(zhǔn)管法,將已知濃度的標(biāo)

11、準(zhǔn)品（其濃度用Cs表示），與待測(cè)樣品在相同條件下顯色、比色。測(cè)出吸光度 ，由于是相同物質(zhì)相同條件。可按照下試求得樣品濃度：,分光光度法的特點(diǎn)：,（1）靈敏度高；（2）準(zhǔn)確度高；（3）操作簡(jiǎn)便快速；（4）應(yīng)用廣泛。,雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量——標(biāo)準(zhǔn)曲線法,,,與硫酸銅的堿性溶液，生成紫色絡(luò)合物。,實(shí)驗(yàn)原理：,蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵，因此有雙縮脲反應(yīng)。在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成

12、正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，因此被廣泛地應(yīng)用。在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，未知樣品的溶液與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液同時(shí)反應(yīng)，并于540nm下比色，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。除－CONH－有此反應(yīng)外，－CONH2－，－CH2－NH2，－CS－NH2等亦有此反應(yīng)。,測(cè)定蛋白質(zhì)含量方法的比較：,凱式定氮法：最經(jīng)典，應(yīng)用范圍廣，靈敏度高0.2~1.0mg 、準(zhǔn)確，不要大儀器，但費(fèi)時(shí)間，有環(huán)境污染。整個(gè)過(guò)程分三步：消化

13、、蒸餾、吸收與滴定。雙縮脲法（Biuret法）：靈敏度較低，1~2mg 。但操作簡(jiǎn)單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)常用此法。Folin－酚試劑法（Lowry法）：較雙縮脲法靈敏，50~100μg。 但易受很多還原性物質(zhì)干擾。紫外吸收法：靈敏， 5 μg， 快速。不同蛋白質(zhì)差異大？考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）：靈敏，1~5 μg，簡(jiǎn)單，誤差大。 BCA比色法：靈敏， 10 μg。單一試劑，終產(chǎn)物穩(wěn)定。幾乎無(wú)干擾

14、。,尿素 urea,,,ActiveSite,,,,,,,,,,,,,,,,A600,mg Protein,BSA,IgG,■ 不同蛋白質(zhì)的定量差異：,,,,Lowry,Absorbance 280 nm,Absorbance 205 nm,Dye-Binding,0.05 - 5 mg,定量方法,靈敏度,0.05 - 0.5 mg,0.05 - 2 mg,0.01 - 0.05 mg,0.01 - 0.05 mg,準(zhǔn)確度,高,中,

15、低,高,中 高,其它說(shuō)明,呈色快速 有腐蝕性銨離子干擾大,呈色較慢多種離子有干擾,樣本可回收其它物質(zhì)干擾大,樣本可回收氧分子干擾極大,呈色快 雜質(zhì)干擾多顏色不易洗除,Biuret,■ 各種蛋白質(zhì)定量法的比較：,葡萄糖氧化酶法測(cè)定葡萄糖含量——標(biāo)準(zhǔn)管法,,,β-D-葡萄糖 + O2 + H2O D-葡萄糖酸酯 + H2O2H2O2 + 4-氨基安替比林 + 酚 醌（紅色）+ H2O,實(shí)驗(yàn)

16、原理：,在葡萄糖氧化酶的催化作用下β-D葡萄糖氧化成過(guò)氧化氫和葡萄糖酸，過(guò)氧化氫在過(guò)氧化物酶的作用下，將4-氨基安替比林與酚偶聯(lián)縮合成可被分光光度計(jì)測(cè)定的紅色醌類(lèi)化合物，即所謂Trinder反應(yīng)。其紅色化合物在510nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與血液葡萄糖濃度成正比。,實(shí)驗(yàn)結(jié)果,葡萄糖含量=AU/AS×5.5 mmol/L,思考題,1、還有其他什么方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量？2、請(qǐng)用雙縮脲法設(shè)計(jì)一個(gè)測(cè)定蛋白質(zhì)含量的