醫(yī)學論文

1、1,Activin A、Inhibin A在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達及意義,專 業(yè)：婦產(chǎn)科學 研究生：李紅云 導(dǎo) 師：黃鳳英副教授,2,主要內(nèi)容,第二章 材料與方法,第三章 結(jié) 果,第四章 附 圖,第五章 討 論,第一章 前 言,第六章 結(jié) 論,3,第一章 前 言,前 言,4,研 究 背 景,前 言,5,子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EMs)，簡稱內(nèi)異癥，是指具有活性的子宮內(nèi)

2、膜組織（腺體和間質(zhì)）出現(xiàn)在子宮內(nèi)膜以外部位。,,前 言,6,內(nèi)異癥是育齡期婦女的多發(fā)病、常見病,不孕,月經(jīng)異常、盆腔包塊,痛經(jīng)、慢性盆腔疼痛,影響生活質(zhì)量,前 言,7,其發(fā)病機制至今尚未闡明，且復(fù)發(fā)率高，治療棘手，國內(nèi)外婦產(chǎn)科學者一直在努力探索其發(fā)病機制，以利于這一疾病的治療而成為婦產(chǎn)科醫(yī)學研究的熱點和難點。,,前 言,8,,,內(nèi)異癥發(fā)病機制現(xiàn)有學說,,,,內(nèi)異癥,誘導(dǎo)學說,免疫學說,子宮內(nèi)膜種植學說,其他學說,體腔上

3、皮化生學說,3A模式學說,淋巴及靜脈播散學說,前 言,9,“3A模式學說”：月經(jīng)期返流的子宮內(nèi)膜需要黏附（Attachment）、侵襲（Aggression），并誘導(dǎo)新生血管形成（Angiogenesis），最終發(fā)展成為有臨床癥狀的疾病。,,前 言,,,生根,生病,生長,內(nèi)異癥,10,前 言,“免疫學說”認為：內(nèi)異癥是一種自身免疫性疾病，機體免疫功能逐漸減退，子宮內(nèi)膜細胞如同腫瘤細胞一樣可能發(fā)生免疫逃逸，對異位內(nèi)膜細胞

4、的特異性免疫減弱，免疫監(jiān)視、清除異位細胞能力下降，使異位內(nèi)膜得以存活、增殖并導(dǎo)致局部纖維增生、粘連。,,11,,,前列腺,,,,,,,生殖組織,非生殖組織,,,,,,,,,,,,腦,,,胎盤,,,子宮內(nèi)膜,,,胰腺,,,腎臟,,,骨髓,,,,,,,,睪丸,垂體,肝臟,腎上腺,Activin A(激活素A)是一種主要由性腺分泌的大分子糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）超家族球蛋白成員。,,,前 言,,卵巢,,12,,,粘附性↑

5、,Activin A,纖維連接蛋白,結(jié)締組織生長因子↑,,,侵襲性↑,Activin A,上皮型鈣粘蛋白↓，MMP-2、3、7、9和 白血病抑制因子↑,,,,Activin A,,促進增殖,,促進血管形成,前 言,13,,內(nèi)異癥是具有類似惡性腫瘤的生物學行為的良性病變,子宮內(nèi)膜細胞的粘附、侵襲、增殖能力及血管形成對內(nèi)異癥的發(fā)病具有極其重要的作用，Activin A雖具有以上生物學作用,但是目前國內(nèi)外關(guān)于Activin A的研究

6、主要集中在PCOS、子癇前期、卵巢腫瘤等婦產(chǎn)科疾病和內(nèi)科的纖維增生性疾病,而其在內(nèi)異癥方面的研究并不多,僅國外少數(shù)學者有研究,國內(nèi)尚無內(nèi)異癥方面的研究。,,前 言,14,,,前 言,Inhibin A（抑制素A）與Activin A一樣，同是大分子糖蛋白，也屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）超家族球蛋白成員。,15,最初對其生物學作用的認識是反饋性抑制垂體FSH的分泌并影響卵泡的生長發(fā)育，后來發(fā)現(xiàn)其也具有生長因子樣作用

7、，在組織再生中調(diào)控組織細胞的生長和分化,而且Inhibin A在細胞免疫中也起作用。而Inhibin A在內(nèi)異癥方面的研究，雖國外已有報道，但國內(nèi)尚處于空白階段。,,前 言,16,二者在內(nèi)異癥的表達如何？是否對內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展起作用？二者是否存在相互關(guān)系？都值得我們研究和探討。,,？,前 言,17,研 究 目 的,前 言,18,免疫組化SP法,檢測Activin A和Inhibin A蛋白在內(nèi)異癥組異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及對

8、照組正常子宮內(nèi)膜中的表達。,探討Activin A和Inhibin A在內(nèi)異癥發(fā)病中的作用及相互關(guān)系。,,,前 言,19,第二章 材料與方法,材料與方法,20,各組患者年齡無統(tǒng)計學差異，月經(jīng)周期規(guī)則，無其他內(nèi)分泌、免疫及代謝性疾病，術(shù)前6個月內(nèi)未接受激素治療。,異位內(nèi)膜（32例）,在位內(nèi)膜（32例）,增生期16例,分泌期16例,增生期18例,分泌期16例,增生期16例,分泌期16例,輸卵管吻合術(shù)、不孕癥（輸卵管因素）、卵

9、巢囊腫。,,,,正常內(nèi)膜（34例）,研 究 對 象,,Ⅰ～Ⅱ期11例，Ⅲ～Ⅳ期21例,材料與方法,,對照組,實驗組,21,主要儀器,普通光學顯微鏡TGW16高速微型離心機DR28429精密可調(diào)微量移液器微波爐BL-220H電子天平4 ℃冰箱,LGE-10-400H超純水機 蓋玻片 載玻片 移液器管咀 塑料修復(fù)盒,材料與方法,22,主要試劑,即用型封閉用兔血清 即用型封閉用羊血清 濃縮型羊抗人Activin A多克

10、隆抗體 即用型兔抗人Inhibin A多克隆抗體 濃縮型兔抗羊IgG-HRP 即用型羊抗兔IgG-HRP 辣根酶標記鏈霉卵白素工作液 AEC顯色試劑盒 蘇木素 甘油明膠,30%過氧化氫 檸檬酸緩沖液 EDTA抗原修復(fù)液 二甲苯 無水乙醇 松節(jié)油 無水磷酸氫二鈉 氯化鉀 磷酸二氫鉀 氯化鈉,材料與方法,23,組織切片,切片常規(guī)脫蠟至水化,滴加3%H2O2室溫10分鐘,滴加封閉用血清工作液,室溫1

11、0-15分鐘,傾去,勿洗,高壓抗原修復(fù),滴加一抗工作液，4℃過夜,滴加二抗工作液,室溫10-15分鐘,AEC顯色劑顯色,蘇木素復(fù)染,封片,鏡檢,滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫10～15分鐘,實驗步驟,材料與方法,24,染色強度 無著色 0淺著色 1中等著色 2強著色 3,陽性細胞數(shù)50% 3,免疫組化積分,+,免疫組化結(jié)果判定,=,Activin A和Inh

12、ibin A蛋白的陽性信號均為細胞漿內(nèi)出現(xiàn)紅色顆粒,用已知陽性片作陽性對照,PBS代替一抗作陰性對照。,,材料與方法,25,統(tǒng)計分析,材料與方法,,,,實驗數(shù)據(jù)運用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，先進行正態(tài)性檢驗符合正態(tài)分布的兩組間的均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗，多組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩測量指標的相關(guān)性采用pearson相關(guān)分析檢驗

13、水準α=0.05(雙尾)，P<0.05表示有顯著性差異。,26,第三章 結(jié) 果,結(jié) 果,27,Activin A蛋白的表達,結(jié) 果,28,Activin A蛋白的表達,結(jié) 果,29,Activin A蛋白的表達,結(jié) 果,30,Activin A蛋白的表達,結(jié) 果,31,Activin A蛋白的表達,結(jié) 果,32,Inhibin A蛋白的表達,結(jié) 果,33,Inhibin A蛋白的表達,結(jié) 果,34,Inhibi

14、n A蛋白的表達,結(jié) 果,35,Inhibin A蛋白的表達,結(jié) 果,36,Inhibin A蛋白的表達,結(jié) 果,37,Activin A與Inhibin A相關(guān)關(guān)系,圖3-11 Activin A蛋白和Inhibin A蛋白在異位內(nèi)膜中表達的相關(guān)性分析,圖3-11 Activin A蛋白和Inhibin A蛋白在在位內(nèi)膜中表達的相關(guān)性分析,圖3-11 Activin A蛋白和Inhibin A蛋白在正常內(nèi)膜中表

15、達的相關(guān)性分析,r=0.925，P＜0.05,r=0.924，P＜0.05,r=0.893，P＜0.05,,呈正相關(guān)關(guān)系,結(jié) 果,38,第四章 附 圖,附 圖,39,圖5正常子宮內(nèi)膜增生期,以下圖片為HE染色，×200,圖6正常子宮內(nèi)膜分泌期,圖3內(nèi)異癥在位內(nèi)膜增生期,圖4內(nèi)異癥在位內(nèi)膜分泌期,圖1內(nèi)異癥異位內(nèi)膜增生期,圖2內(nèi)異癥異位內(nèi)膜分泌期,附 圖,40,以下圖片為免疫組化AEC染色，×200,,,,,附

16、 圖,圖7 Activin A蛋白在前列腺增生癥組織中的陽性表達（陽性對照）,圖8 Activin A蛋白在子宮內(nèi)膜組織中的陰性表達（陰性對照）,圖11 Activin A蛋白在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜增生期呈陽性表達,圖12 Activin A蛋白在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜分泌期呈陽性表達,,圖9 Activin A蛋白在內(nèi)異癥異位內(nèi)膜增生期呈強陽性表達,,圖10 Activin A蛋白在內(nèi)異癥異位內(nèi)膜分泌期呈強陽性表達,41,以下圖片為免疫

17、組化AEC染色，×200,,,附 圖,圖15 Inhibin A蛋白在腎上腺皮質(zhì)腺瘤組織中的陽性表達（陽性對照）,圖16 Inhibin A蛋白在子宮內(nèi)膜組織中的陰性表達（陰性對照）,,圖13 Activin A蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織增生期呈弱陽性表達,,圖14 Activin A蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織分泌期呈弱陽性表達,,圖17 Inhibin A蛋白在內(nèi)異癥異位內(nèi)膜增生期呈強陽性表達,,圖18 Inhibin A蛋白在內(nèi)

18、異癥異位內(nèi)膜分泌期呈強陽性表達,42,以下圖片為免疫組化AEC染色，×200,,,附 圖,圖19 Inhibin A蛋白在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜增生期呈陽性表達,圖20 Inhibin A蛋白在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜分泌期呈陽性表達,,圖21 Inhibin A蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織增生期呈弱陽性表達,,圖22 Inhibin A蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織分泌期呈弱陽性表達,43,第五章 討 論,討 論,44,Activin A、Inhib

19、in A均為轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族球蛋白成員。,,,Inhibin α,InhibinβA,InhibinβA,InhibinβA,-S-S-,-S-S-,Activin A,Inhibin A,,討 論,Activin A和Inhibin A的結(jié)構(gòu),45,細胞粘附性,細胞侵襲性,細胞增殖,血管形成,Activin A,,,,,,,Activin A的作用,討 論,纖維連接蛋白、結(jié)締組織生長因子↑,VEGF和VEGF受體

20、↑，作為自分泌因子增強VEGF的作用,上皮型鈣粘蛋白↓MMP-2、3、7、9和白血病抑制因子↑,旁分泌作用,,,,46,,,,,,異位,在位,正常,Activin A在各組內(nèi)膜的表達,,,各組內(nèi)膜都能產(chǎn)生Activin A,與國外學者Reis和Mabuchi的研究結(jié)果相似。,,內(nèi)異癥組異位和在位內(nèi)膜較正常內(nèi)膜能產(chǎn)生更多的Activin A,說明其在內(nèi)異癥的發(fā)病中可能起作用,與Rombauts的研究結(jié)果一致。,討 論,,,

21、,Activin A在異位內(nèi)膜高表達可能通過增加細胞粘附性、侵襲性、增殖能力，并促進血管形成而促進內(nèi)異癥發(fā)生。佐證了“3A發(fā)病模式”。,47,,,Activin A蛋白在正常內(nèi)膜:分泌期＞增生期,與Ciarmela的研究結(jié)果一致,提示分泌期的子宮內(nèi)膜細胞較增生期子宮內(nèi)膜細胞能產(chǎn)生更多的Activin A。我們還發(fā)現(xiàn)：Activin A蛋白在內(nèi)異癥組異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜：分泌期＞增生期，提示Activin A蛋白在

22、腺上皮細胞中的周期性表達似與卵巢激素的周期性分泌相關(guān),可能與雌、孕激素的調(diào)節(jié)有關(guān)。,,,Activin A在月經(jīng)周期的表達,討 論,48,推測,,與病情嚴重程度相關(guān),,,Ⅲ～Ⅳ期＞Ⅰ～Ⅱ期,隨著內(nèi)異癥病變的發(fā)展，異位病灶與周圍組織器官形成過度纖維化，可導(dǎo)致瘢痕形成、慢性盆腔疼痛以及受累的組織器官功能減弱甚至散失，為卵巢異位囊腫的臨床特征之一。,研究表明Activin A能通過促進Ⅰ型膠原的表達促進肝纖維化、腎纖維化、

23、肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展。,已有研究證實Ⅰ型膠原是內(nèi)異癥纖維化最主要的因子。,Activin A在不同臨床分期的表達,,Activin A也可能通過增加Ⅰ型膠原的表達促進內(nèi)異癥纖維化進展，從而加重病情,是內(nèi)異癥發(fā)展中的一個重要因素。,,討 論,49,,,Findlay研究發(fā)現(xiàn)Inhibin與Activin、TGF-β、巨噬細胞游走抑制因子等都是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員,具有自分泌、旁分泌生長因子活性，參與垂

24、體、性腺、胎盤等多種組織細胞的生長和分化。,Inhibin A可減少Ⅱ型主要組織相容性復(fù)合物(MHCⅡ)的表達,MHCⅡ是抗原呈現(xiàn)和T細胞通過T細胞受體活化所必需的,其表達減少則導(dǎo)致T細胞反應(yīng)降低,從而降低免疫反應(yīng),而且Inhibin A還可抑制免疫活性細胞(如巨噬細胞)的補充和活化,Inhibin A的作用,討 論,50,,不僅如此，我們的結(jié)果還表明內(nèi)異癥組異位內(nèi)膜較在位內(nèi)膜和正常內(nèi)膜能產(chǎn)生更多的Inhib

25、in A，在位內(nèi)膜較正常內(nèi)膜也能產(chǎn)生更多的Inhibin A，可能是內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展的原因之一。,,表明各組內(nèi)膜都能產(chǎn)生Inhibin A,與國外學者Reis、Akande的研究結(jié)果一致。,Inhibin A在各組內(nèi)膜的表達,,,異位,在位,正常,,,,討 論,51,生長因子樣作用,降低免疫反應(yīng),Inhibin A異位內(nèi)膜高表達,,,內(nèi)異癥的發(fā)生,討 論,,,52,,本研究發(fā)現(xiàn)Inhibin A蛋白在各組內(nèi)膜的表達：分泌期

26、＞增生期,與Anderson和Klein的研究結(jié)果一致，提示Inhibin A分泌高峰在黃體期。,Inhibin A在月經(jīng)周期中的表達,,討 論,53,,本研究結(jié)果還顯示Inhibin A蛋白在內(nèi)異癥Ⅲ～Ⅳ期的表達強于Ⅰ～Ⅱ期。提示內(nèi)異癥患者Inhibin A蛋白表達水平與內(nèi)異癥的進展有關(guān)。,Inhibin A在不同臨床分期的表達,,討 論,54,Activin A與Inhibin A的相互關(guān)系,,,,,,我們的實驗：二者

27、在各組內(nèi)膜均存在正相關(guān)關(guān)系（P<0.05）,Activin A,Inhibin A,Activin A和Inhibin A在內(nèi)異癥發(fā)病中可能存在協(xié)同作用，但具體作用機制值得進一步研究探討。,,,討 論,55,第六章 結(jié) 論,結(jié) 論,56,1 Activin A和Inhibin A在內(nèi)異癥表達增強，提示Activin A和Inhibin A可能參與內(nèi)異癥發(fā)??；2 Activin A和Inhibin A在各組子宮內(nèi)膜組

28、織中的表達與月經(jīng)周期有關(guān)；3 Activin A和Inhibin A的表達與內(nèi)異癥臨床分期有關(guān)，提示二者可能參與內(nèi)異癥的發(fā)展；4 Activin A和Inhibin A在各組子宮內(nèi)膜組織中的表達水平呈正相關(guān)關(guān)系，提示二者在內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展過程中有協(xié)同作用。,,,,,結(jié) 論,57,致 謝 三年的碩士生涯馬上就要過去，回憶起這三年的點點滴滴，感觸很深，在此，我要衷心的感謝每一位關(guān)心和幫助過我的人們！

29、 首先衷心感謝我敬愛的導(dǎo)師黃鳳英副教授對我學習、工作上的悉心教導(dǎo)和生活上的關(guān)心和照顧。恩師嚴謹?shù)闹螌W態(tài)度、縝密的科學思維、淵博的知識、高尚的醫(yī)德、精湛的醫(yī)術(shù)和對事業(yè)執(zhí)著的追求，是我終生學習的榜樣。每次回想起恩師為了學生的事情不辭辛苦，哪怕是白天辛苦一天，晚上再晚也不忘為我們的事情操勞，我的心就一次次被震撼著，恩師，謝謝您！您很偉大！我們很幸福！能成為您的學生是我這一生莫大的財富！ 衷心感謝中南大學湘雅二醫(yī)

30、院婦產(chǎn)科的方小玲、劉鳳英、吳宜林、張洪文、陶光實、朱付凡、丁依玲、張麗娟、劉毅智、施曉波、黃健、符淳、鄧文、王新、皮丕湘、吳獻青、范紅、聶妹芳、彭梅、王麗瓊、喻玲、鄧婭莉、丁暉、宋婉娟、花蘭、李菡、楊元娟、熊晶、章婷婷、施華芳、徐潤芝、鄒燕輝等各位老師對我學習和生活的指導(dǎo)和關(guān)心。感謝婦科全體老師在我實驗收集標本中給予的大力幫助！ 衷心感謝中南大學湘雅二醫(yī)院病理科老師對我的幫助與支持！ 衷心感謝師姐劉秋紅、鄒穎

31、、王煥萍、劉玉娟、邵文靜，師妹胡柏帆，同學楊倩、賀艷麗、劉曉旭、王常青在實驗過程中的熱情幫助！ 衷心感謝在百忙之中抽出時間審閱本論文的專家教授，感謝答辯委員會的各位老師和專家們對我的論文提出的寶貴建議！ 衷心感謝我的愛人和我的親人在學習上和生活中對我的理解、支持與幫助！ 衷心感謝各位患者在課題實施過程中對我的支持！ 再次衷心感謝所有幫助過我的良師益友和親人們！,向答辯委員會主席、