動物醫(yī)學(xué)畢業(yè)論文rtpcr隱孢子蟲雞胚

1、河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院2011屆動物醫(yī)學(xué)專業(yè)畢業(yè)論文1RealtimeqPCR檢測雞胚中貝氏隱孢子蟲方法研究郭官鵬（2011屆動物醫(yī)學(xué)專業(yè)3班）摘要：為檢測雞胚中貝氏隱孢子蟲，本研究根據(jù)GenBank公布的貝氏隱孢子蟲和原雞18SrRNA基因序列設(shè)計針對貝氏隱孢子蟲的特異性引物，并以標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA為模板，建立貝氏隱孢子蟲SYBRGreen實(shí)時熒光定量PCR（RealtimeqPCR）方法，并對含有貝氏隱孢子蟲的雞胚尿囊液樣品進(jìn)行檢測

2、。結(jié)果表明，建立的SYBRGreenRealtimeqPCR方法可特異性擴(kuò)增出貝氏隱孢子蟲，而且建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好(R2=0.998)。進(jìn)一步做重復(fù)性結(jié)果顯示試驗(yàn)重現(xiàn)性較好。本研究建立了快速、特異的定量檢測雞胚中貝氏隱孢子蟲RealtimeqPCR方法，可用于對貝氏隱孢子蟲在雞胚中繁殖規(guī)律分析和藥物篩選評估。關(guān)鍵詞：RealtimeqPCR；貝氏隱孢子蟲；雞胚EstablishmentofaSYBRGreenRealTimeqP

3、CRAssayfDetectionofCryptospidiumBaileyiinchioallantoicmembraneGUOGuanpeng(Class3ofVeterinaryMedicineGraduatedin2011)Abstract：IndertodetectCryptospidiumbaileyiinallantoicfluidRealtimeqPCRmethodwasestablishedwithprimersdes

4、ignedaccdingtheC.baileyichicken18SrRNAfromGenBank.ThismethodwasvalidatedonallantoicfluidsamplesincludingC.baileyi.TheresultsshowedthatamplificationofDNAfromtheC.baileyiweredetectedotherswerenot(C.ersonichioallantoicmembr

5、anechickembryotrachealEimeriatenellaEscherichiacoli).StardcurvesofRealtimeqPCRwasprecise(R2=0.998).InsummaryarapidspecificRealtimeqPCRmethodfthedetectionofC.baileyiinallantoicfluidsampleshasbeendevelopedwhichcouldbeserve

6、dasavaluabletoolfevaluatingproductionassessingpotentialdrugofC.baileyiinchickenembryo.Keywds:RealtimeqPCRCryptospidiumbaileyiChickenembryo隱孢子蟲(Cryptospidium)是寄生于人和動物胃腸道和呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)能引起人畜共患隱孢子蟲病(cryptospidiosis)的一種原蟲[1]?，F(xiàn)今，包括

7、中國在內(nèi)，在世界6大洲90個國家300多個地區(qū)已發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲，其能感染包括人在內(nèi)的240多種動物[2]。對于免疫功能正常宿主，其主要引起自限性腹瀉。對于免疫抑制患者，尤其是獲得性免疫缺陷綜合癥（AIDS）患者，感染后危害嚴(yán)重，且常常引起死亡[3]。貝氏隱孢子蟲（C.baileyi）為感染雞的優(yōu)勢種，主要寄生于雞喉頭、氣管、法氏囊和泄殖腔等部位，可引起雛雞呼吸道癥狀，導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降甚至死亡；當(dāng)與其它免疫抑制性病原混合感染時，將造成更嚴(yán)重

8、的經(jīng)濟(jì)損失[4]。世界上大多數(shù)國家均有雞隱孢子蟲病的報道，美國喬治亞州蛋雞群感染率為10％~60％，肉雞群為41％；蘇格蘭雞群感染率為88％[5]。在我國，不同地域報道的雞隱孢子蟲感染率差河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院2011屆動物醫(yī)學(xué)專業(yè)畢業(yè)論文3在25l體系中加入以下成份：SYBRPreMix(5Ul)15lP10.5lP20.5lDNA1lddH2O8l1.4.4特異性試驗(yàn)C.baileyi、安氏隱孢子蟲、雞胚尿囊膜細(xì)胞、雞胚氣管環(huán)細(xì)胞

9、、雞柔內(nèi)艾美爾球蟲和大腸桿菌DNA模板均由本實(shí)驗(yàn)室提供，共同進(jìn)行RealtimeqPCR。1.4.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將含1106個C.baileyi卵囊DNA分別稀釋成含1106、1105、1104、1103、1102卵囊DNA，建立C.baileyi18SrRNA基因RealtimeqPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.4.6重復(fù)性試驗(yàn)將上述含1106、1105、1104、1103、1102卵囊DNA分別擴(kuò)增3次，對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。1.4.7雞

10、胚尿囊液中C.baileyi18SrRNA基因擴(kuò)增采用上述DNA提取方法及RealtimeqPCR反應(yīng)體系，進(jìn)行雞胚尿囊液中C.baileyi18SrRNA基因擴(kuò)增。2結(jié)果與分析2.1引物特異性試驗(yàn)結(jié)果用C.baileyi18SrRNA基因引物擴(kuò)增C.baileyi、安氏隱孢子蟲、雞胚尿囊膜細(xì)胞、雞胚氣管環(huán)細(xì)胞、雞柔內(nèi)艾美爾球蟲和大腸桿菌DNA模板，僅有C.baileyi模板能夠擴(kuò)增出曲線，其它試驗(yàn)所用模板均不能擴(kuò)增出曲線，說明該引物對

11、C.baileyi具有特異性，可以有效準(zhǔn)確擴(kuò)增出雞胚中C.baileyi。結(jié)果見圖1。圖1特異性曲線A.貝氏隱孢子蟲；B.安氏隱孢子蟲；C.雞胚尿囊膜；D.雞胚氣管環(huán)；E.雞柔內(nèi)艾美爾球蟲；F.大腸桿菌Fig.1CurveofspecificityA.C.baileyiB.C.ersoniC.chioallantoicmembraneD.chickembryotrachealE.EimeriatenellaF.Escherichiaco