豬霍亂沙門氏菌攜帶的含APP apxIIA基因的雙啟動子表達載體pEPR-apxIIA的構(gòu)建.pdf

1、豬霍亂沙門氏菌C500株不僅可以作為預防豬沙門氏菌病的活疫苗，還可作為載體運送其他DNA疫苗，并通過口服免疫誘導產(chǎn)生針對特定抗原的各種免疫應答。本研究將rrnbT1T2轉(zhuǎn)錄終止序列插入真核表達質(zhì)粒pEGFP-C1的多克隆位點MCS下游，構(gòu)建成pEGFP-rrnBT1T2。然后根據(jù)原核啟動子Ptrc結(jié)構(gòu)設(shè)計并人工合成該雜合啟動子，將其置于pEGFP-rrnBT1T2的真核啟動子CMVIE下游，構(gòu)建成雙啟動子表達載體pEGFPPtrcR，用

2、1×TSS法轉(zhuǎn)化已經(jīng)鑒定好的豬霍亂沙門氏菌C500株，得到工程菌C500/pEGFPPtrcR，該菌的保持了C500原有的生長特性、生化特性及血清學特征，在體外至少能穩(wěn)定遺傳20代。為驗證pEGFPPtrcR的有效性，檢測了報告基因EGFP在原核細胞和真核細胞中表達情況。在熒光顯微鏡下可觀察到單個工程菌C500/pEGFPPtrcR發(fā)出綠色熒光，經(jīng)SDS-PAGE檢測表達蛋白約為27KD，與預期相符。采用脂質(zhì)體介導法將pEGFPPtrc

3、R質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核Vero細胞24h后也觀察到綠色熒光。表明，能同時進行原核和真核表達的雙啟動子表達載體pEGFPPtrcR構(gòu)建成功。預示雙啟動子表達載體pEGFPPtrcR攜帶的外源基因既可在沙門氏菌C500中表達，又可在體細胞中表達，抗原的表達量增加因而可誘導更強的免疫應答，在研制新型重組沙門氏菌疫苗方面有著誘人的應用前景。 豬傳染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜

4、肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一種豬傳染性呼吸道疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。預防和控制該病的主要措施是疫苗免疫接種。參照GenBank中APP的apxⅡA基因序列，設(shè)計一對特異性引物(apxⅡA 1和apxⅡA2)，以本實驗室分離的APP-CYY株的基因組DNA為模板，擴增出apxⅡA全基因，測序結(jié)果顯示，apxⅡA基因全長2871bp，與GenBank中其他5個

5、APP菌株的apxⅡA同源性高達99.5-99.9％。氨基酸序列分析，該基因編碼957個氨基酸，具有典型RTX毒素特征，無信號肽。將該基兇插入雙啟動子表達載體pEGFPPtrcR的MCS中，構(gòu)建成雙啟動子表達質(zhì)粒pEPR-apxⅡA，用1×TSS法轉(zhuǎn)化豬霍亂沙門氏菌C500株，得到工程菌C500/pEPR-apxⅡA，該菌保持了C500原有的生長特性、生化特性及血清學特征，在體外至少能穩(wěn)定遺傳20代。其在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光，經(jīng)

6、SDS-PAGE檢測，EGFP與apxⅡA的融合表達蛋白約為130KD。用脂質(zhì)體介導法將pEPR-apxⅡA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核 Vero 細胞細胞24h后也檢測到綠色熒光。證明，雙啟動子表達質(zhì)粒pEPR-apxⅡA構(gòu)建成功，可在原核細胞和真核細胞中表達。為構(gòu)建以C500為載體的高效豬傳胸DNA活疫苗打下了堅實的基礎(chǔ)，進而為研制豬傳染性胸膜肺炎和仔豬副傷寒二價疫苗的開辟了道路。 invA基因是沙門氏菌的侵襲蛋白，可通過同源重組的方式將其

7、缺失突變從而可能進一步降低豬霍亂沙門氏菌C500的毒力。以C500基因組為模板，擴增了C500 invA兩側(cè)基因invB和invE；以pEGFPPtrcR質(zhì)粒為模板，擴增了pTER，含有原核啟動子Ptrc和EGPF。按照沙門氏菌基因組中invB-invA-invE基因的排列方向和順序，將它們連接入pUC18載體中，并通過酶切補平連接方式，除去了inB端的Hind Ⅲ和invE端的EcoRI酶切位點，保證pTER中MCS的使用完整性。構(gòu)建