減毒雞傷寒沙門(mén)氏菌△asd缺失株的構(gòu)建及其攜帶外源基因的表達(dá).pdf

1、沙門(mén)氏菌是一種非常重要的人獸共患病病原菌，主要引起人和動(dòng)物的發(fā)熱、腸炎、敗血癥等多種疾病癥狀，呈全球性分布。沙門(mén)氏菌為胞內(nèi)侵襲性細(xì)菌，能有效呈遞抗原，激發(fā)抗沙門(mén)氏菌和誘導(dǎo)外源蛋白的特異性體液免疫與細(xì)胞免疫，并能同時(shí)誘導(dǎo)黏膜免疫與全身免疫。近幾年，沙門(mén)氏菌常通過(guò)宿主載體平衡致死系統(tǒng)構(gòu)建新型疫苗載體。 減毒雞傷寒沙門(mén)氏菌疫苗株97A是經(jīng)轉(zhuǎn)座突變及粗糙變異篩選所獲得，本實(shí)驗(yàn)室已從安全性、免疫效力和病理組織學(xué)等各個(gè)方面對(duì)97A疫苗株作出

2、評(píng)價(jià)，研究結(jié)果表明，該減毒株具有較好的安全性和免疫效力。本研究旨在研制更加安全的減毒雞傷寒沙門(mén)氏菌97A疫苗株，并將其開(kāi)發(fā)為新型活疫苗載體。以97A為親本菌，缺失基因組中編碼天冬氨酸-β-半乳糖脫氫酶的asd基因，構(gòu)建asd宿主載體平衡致死系統(tǒng)，用于高效表達(dá)外源基因，初步應(yīng)用該系統(tǒng)表達(dá)了紅色熒光蛋白基因和新城疫F蛋白基因部分片段，為研制新型載體疫苗奠定了基礎(chǔ)。 1.減毒雞傷寒沙門(mén)氏菌97A△asd缺失株的構(gòu)建與鑒定 為了

3、研制更加安全的雞傷寒沙門(mén)氏菌弱毒株，并使其開(kāi)發(fā)為活疫苗載體，本研究構(gòu)建了雞傷寒沙門(mén)氏菌97A△asd缺失株，并以此建成宿主載體平衡致死系統(tǒng)。根據(jù)雞傷寒沙門(mén)氏菌asd基因已發(fā)表的基因序列，設(shè)計(jì)并合成了2對(duì)引物，PCR方法擴(kuò)增了asd上下游序列。通過(guò)氯霉素抗性基因替代asd基因中間片段，構(gòu)建重組自殺性質(zhì)粒，與雞傷寒沙門(mén)氏菌野生菌接合轉(zhuǎn)移，兩步法篩選△asd缺失株。結(jié)果表明，△asd缺失株被成功構(gòu)建，命名為97A△asd缺失株，其表型、生長(zhǎng)特

4、性及生化特征與野生菌保持一致?；蚧パa(bǔ)試驗(yàn)結(jié)果顯示，該突變株能穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白，即該宿主載體平衡致死系統(tǒng)能高效表達(dá)外源基因，為雞傷寒沙門(mén)氏菌載體疫苗的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。 2.新城疫病毒F基因部分片段在減毒雞傷寒沙門(mén)氏菌97A△asd缺失株中的表達(dá) 以重組質(zhì)粒pVAXl-F為模板擴(kuò)增594 bp的NDV-F基因部分片段，亞克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pYA3334中，獲得X6212(pYA3334-F)。從大腸桿菌X6212

5、提取重組質(zhì)粒pYA3334-F，并將其電轉(zhuǎn)化沙門(mén)氏菌中間宿主X3730進(jìn)行甲基化處理，最后將甲基化的原核表達(dá)質(zhì)粒pYA3334-F電轉(zhuǎn)化X4550，SDS-PAGE電泳和免疫試驗(yàn)檢測(cè)到F表達(dá)。將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pYA3334-F電轉(zhuǎn)化97A△asd缺失株，SDS-PAGE電泳檢測(cè)F表達(dá)。攜帶F的重組菌97A(pYA3334-F)及對(duì)照菌97A(pYA3334)以1△109 CFU/只肌注免疫雛雞，結(jié)果表明該重組菌是安全的，免疫組產(chǎn)生了