糖的組織化學(xué)

1、組織化學(xué) histochemistry特殊染色, 通過應(yīng)用某些能與組織細(xì)胞化學(xué)成分特異性結(jié)合的顯色試劑,定位地顯示病變組織細(xì)胞的特殊化學(xué)成分,同時又能保存原有的形態(tài)改變, 達(dá)到形態(tài)與代謝的結(jié)合.可用于檢測細(xì)胞內(nèi)的酶類、糖類、脂類、核酸、某些金屬元素等。,糖 的 組 織 化 學(xué),糖的分類,單糖和雙糖多糖：淀粉、纖維素、糖原粘液物質(zhì)（粘多糖） 中性粘多糖 酸性粘多糖糖蛋白 粘蛋白 氨

2、基己糖>4% 糖蛋白 氨基己糖<4%5. 糖脂 含有半乳糖, 脂肪酸,神經(jīng)氨基醇,,,糖 原,一. 糖原的概念,由多糖衍化而來，是天然存在于動物組織內(nèi)的多糖 分布：胞漿內(nèi) 肝、心肌、骨骼肌 同種葡萄糖的聚合物 作為糖原染色的切片，必須冰凍或經(jīng)特殊固定液固定后進(jìn)行切片,二.固定劑的選用,Carnoy（冷4℃） 無水乙醇 60

3、ml 防止糖原溶于水 氯 仿 30ml 增加滲透力 冰 醋 酸 10ml 抵消乙醇對組織的 收縮、硬脆作用 *優(yōu)點(diǎn)：固定迅速，保存肝糖原,2. Gendre （冷4℃） 苦味酸無水乙醇飽和液 80ml 甲醛

4、15ml 冰醋酸 5ml臨用前混合配制,3. Lillie固定液（AAF） 無水乙醇 85ml 冰醋酸 5ml 甲醛 10ml 固定液預(yù)冷4℃，固定24h后，95%乙醇脫水，包埋,三.固定中注意事項(xiàng),1.盡可能取小塊新鮮組織及時固定，不用水溶性固定液2.應(yīng)用含酒精的溶液作為固定液，但

5、最好不單獨(dú)使用乙醇固定，以乙醇為溶劑的混合固定液固定為佳3.固定原理：使糖原與固定液之間相結(jié)合的蛋白質(zhì)凝固，糖原被周圍凝固的蛋白質(zhì)膜保護(hù)起來，,四.顯示糖原的方法,1. 碘染色 2. 胭脂紅染色 *3. 過碘酸-Schiff 反應(yīng) 4. 銀浸染法,過碘酸-Schiff 反應(yīng),Periodicacid-Schiff, PAS,(一）染色原理,過碘酸是一種強(qiáng)氧化劑，能氧化糖分子，使相鄰二個碳原子上的羥基（-OH）變?yōu)槿┗?C

6、OOH）,Schiff氏試劑是付品紅（堿性品紅）經(jīng)SO2作用后，形成的無色溶液,付品紅,Schiff試劑,當(dāng)Schiff氏試劑與醛基作用后，形成含有發(fā)色基團(tuán)的化合物，呈現(xiàn)紫紅色沉淀,*PAS反應(yīng)的基本原理 1. 通過過碘酸的氧化作用，將糖分子中的碳鍵打斷，游離出醛基 2. 醛基與Schiff試劑反應(yīng)顯出紅色沉淀,(二) 染色步驟,1.切片脫蠟至水2.1%過碘酸溶液內(nèi)氧化5-10min3.流水洗5min, 再用蒸餾水洗

7、4.用Schiff試劑處理10-20min5.流水洗10min6.復(fù)染(可用Mayer明礬蘇木素或甲基綠襯染細(xì)胞核)7.脫水、透明、封片,切片經(jīng)二甲苯和各級酒精復(fù)水后，入0.5%的過碘酸溶液中作用15分鐘，取出后水洗。,切片充分洗凈后入Schiff‘s試劑中進(jìn)行顯色。作用15分鐘左右，將切片取出水洗，為洗去非特異性著色，將切處理品入三級新配制的亞硫酸中進(jìn)行沖洗，取出后水洗，鏡檢。,肝糖原-PAS染色 X200,肝糖原- PAS

8、+蘇木素復(fù)染 X200,【結(jié)果】 胞漿內(nèi)PAS陽性物質(zhì)呈紫紅色，顆粒狀或均質(zhì)團(tuán)塊狀，胞核呈藍(lán)色或綠色 紅色深淺反應(yīng)含糖原量的多少【對照】 采用淀粉酶或唾液酶消化切片 對照片PAS（-），未處理片（+）,This normal glomerulus is stained with PAS to highlight basement membranes. The capillary loops of th

9、e glomerulus are well-defined and thin.,A888 kidney 11-PAS,A888 kidney 14-PAS,（三）PAS反應(yīng)的應(yīng)用,證明與鑒別細(xì)胞內(nèi)空泡樣變性 （水變性、脂肪變性、糖原）心肌病變及其它心血管疾病的診斷和研究糖原累積病的診斷及研究糖尿病的診斷及研究某些腫瘤的診斷與鑒別,肝細(xì)胞水變性,肝脂肪變性 (石蠟切片),肝脂肪變性 (冰凍切片),脂肪特染：蘇丹III,糖原

10、累積癥,PAS（+） PAS（-） 肝細(xì)胞癌 膽管癌 橫紋肌瘤 顆粒細(xì)胞肌母細(xì)胞瘤 Ewing肉瘤 骨的網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤,（四）注意事項(xiàng),1.過碘酸溶液與Schiff試劑均可反復(fù)使用多次，用后密封放入冰箱4℃保存2.新鮮配成的溶液與應(yīng)用過的作用時間不同，剛配成的作用時間短，以后逐漸

11、延長3.過碘酸溶液在作用前應(yīng)與室溫接近，溫度太低，造成氧化不全，影響效果4. Schiff試劑如呈淡紅色，則應(yīng)棄去重配,5. Schiff試劑配法很多，區(qū)別不大，可以隨意選用6. Schiff試劑作用時，染色缸必須加蓋，不然Schiff試劑將因SO2消失而失效,Schiff試劑,堿性復(fù)紅 1g 1N鹽酸 20ml 偏重亞硫酸鈉 1g 重蒸餾

12、水 200ml,粘 液 物 質(zhì)(粘 多 糖),人體的各種腺體及其他許多組織、細(xì)胞，如結(jié)締組織、纖維母細(xì)胞、軟骨基質(zhì)等都能合成和分泌粘液物質(zhì)，統(tǒng)稱為粘多糖 或粘液,分類,中性粘多糖酸性粘多糖 1.硫酸化粘液物質(zhì) 結(jié)締組織 （強(qiáng)） 上皮 （弱） 2.非硫酸化粘液物質(zhì)

13、 含己糖醛酸的結(jié)締組織粘液物質(zhì) 含唾液酸的上皮粘液物質(zhì),,,粘液物質(zhì)染色在診斷中的應(yīng)用,用于一般粘液性病變的觀察腫瘤的診斷與研究：用顯示粘液的染色方法進(jìn)行觀察和鑒別,胃粘膜上皮分泌中性粘液，而胃腸上皮化生或腸型胃癌細(xì)胞分泌酸性粘液 --AB-PAS染色區(qū)分中性與酸性粘多糖酸性粘多糖含有硫酸基團(tuán)和羧基。用陽離子染料與酸性基團(tuán)結(jié)合形成鹽鍵而顯色。利用染液不同的PH值及不同的電解質(zhì)濃度，可以區(qū)

14、別酸性粘多糖的二種基團(tuán) --HID-AB法,不同PH的競爭性抑制 PH2.5時，二種酸性粘多糖均被奧藍(lán)著色 PH1.0時，僅硫酸粘多糖著色,2.電解質(zhì)濃度與粘液物質(zhì)著色的關(guān)系,MgCl2濃度 顯示物 0.06M 羧酸和硫酸化粘液 0.3M 弱和強(qiáng)硫酸化粘液 0.5M

15、 強(qiáng)硫酸化粘液 0.7M 強(qiáng)硫酸化結(jié)締組織粘液 0.9M 硫酸角質(zhì),,顯示糖分子和酸性基團(tuán)的 組化方法,1.奧藍(lán)-過碘酸Schiff氏法（AB-PAS）,【目的】鑒別胃粘液（中性粘多糖）和腸粘液（酸性粘多糖）；對鑒定腸上皮化生有一定意義,【染色原理】,奧藍(lán)是一種水溶性氰化亞鈦銅

16、鹽，帶有陽電荷，與組織中的酸根結(jié)合形成鹽鍵。 AB-PAS法：首先酸性粘多糖為奧藍(lán)染色，不再與PAS發(fā)生反應(yīng)；僅中性粘多糖為PAS陽性,【染色步驟】,1.石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水洗2.1%奧藍(lán)的醋酸（3%）液染30分鐘（PH約2.5）3.蒸餾水洗4.1%過碘酸液氧化5-10min5.蒸餾水洗6.Schiff試劑作用10-30min7.流水洗10min8.脫水，透明，封片,Alcin blue染色液： 奧藍(lán)1g，

17、蒸餾水97ml，冰醋酸3ml 臨用前過濾使用，調(diào)節(jié)PH2.5-3之間【結(jié)果】 中性粘多糖（胃粘液）呈紅色，酸性粘多糖（腸粘液）呈藍(lán)色，酸性和中性混合粘液呈紫紅色,AB-PAS X100,AB-PAS X200,2.高鐵雙胺-奧藍(lán)法（HID-AB）法,【目的】 主要用于鑒別硫酸化粘多糖和唾液酸粘多糖，對確定腸化生類型有一定價值正常胃粘膜上皮，十二指腸腺——中性粘液小腸——氮乙酰化唾液酸

18、粘液大腸——氧乙酰化唾液酸粘液和硫酸粘液,腸型胃癌 唾液酸粘液 硫酸粘液彌漫型胃癌 中性粘液高分化腺癌 硫酸粘液中低分化腺癌 唾液酸粘液大腸型化生 硫酸粘液小腸型化生 不含硫酸粘液,,,,高鐵雙胺染液,N，N-二甲基-間-苯二胺二鹽酸鹽 120mg N，N-二甲基-對-苯

19、二胺二鹽酸鹽 20mg 溶于預(yù)熱至25℃的蒸餾水50ml中，再加入60% FeCl3.6H20 1.5ml (PH1.4-1.5),【染色原理】,二胺鹽離解后帶陽電荷，與硫酸化粘液物質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物而顯色。 該反應(yīng)緩慢，需加入FeCl3作為催化劑 FeCl3的作用 -使二胺鹽氧化形成棕黑色陽離子色原，加快染色 -使染色液的PH降至1.4 以后奧藍(lán)（PH2.5）把羧基化的唾液酸粘液染成藍(lán)色,【染色步驟】,