現(xiàn)代組織化學(xué)技術(shù)

1、現(xiàn)代組織化學(xué)技術(shù)(Modern Histochemical Technology),現(xiàn)代組織化學(xué)是介于細(xì)胞生物學(xué)、組織學(xué)、生物化學(xué)及分子生物學(xué)之間的交叉學(xué)科，它已滲透和應(yīng)用于生命科學(xué)的許多領(lǐng)域。近幾十年來(lái)，組織化學(xué)發(fā)展突飛猛進(jìn)，日新月異，已產(chǎn)生了許多分支，各類分支雖有特點(diǎn)，但都源于組織化學(xué)。因此，組織化學(xué)已成為醫(yī)學(xué)生物學(xué)科研過(guò)程中必備知識(shí)之一。,免疫組織化學(xué)免疫電鏡組織化學(xué)原位雜交技術(shù)原位PCR技術(shù),組織化學(xué)的發(fā)展,組織化學(xué)是

2、在組織學(xué)和化學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，早在十九世紀(jì)，人們把顯微鏡與化學(xué)技術(shù)結(jié)合起來(lái)，開始觀察組織中的化學(xué)反應(yīng)，解釋生物界中的生理現(xiàn)象。,(1890一1920)隨著顯微鏡的改進(jìn)和組織細(xì)胞學(xué)染色技術(shù)的發(fā)展，組織細(xì)胞化學(xué)開始從生理組織學(xué)的概念轉(zhuǎn)為顯微化學(xué)。依賴細(xì)胞內(nèi)的某些酶催化特異底物的化學(xué)反應(yīng)形成酶細(xì)胞化學(xué)。70年代由于細(xì)胞顯微分光光度法和熒光顯微光度法的建立，使細(xì)胞化學(xué)的成分得以定量，形成了定量細(xì)胞化學(xué)。,80年代電鏡細(xì)胞化學(xué)可以觀察化學(xué)

3、成分的亞細(xì)胞定位。80 ～ 90年代，先后流式細(xì)胞術(shù)、激光掃描共聚焦顯微技術(shù)出現(xiàn)。本世紀(jì)初，激光捕獲顯微切割技術(shù)（Laser capture microdissection，LCM）。,激光掃描共聚焦顯微技術(shù)（laser scanning confocal microscope，LSCM），相似于對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞“CT”分析，并能研究活細(xì)胞和定量分析細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)DNA、RNA、細(xì)胞器的酶含量，細(xì)胞內(nèi)各種熒光標(biāo)記物(包括分子和離

4、子的濃度及其分布，如Ca2+和pH值等)。,流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是一種快速對(duì)單細(xì)胞化學(xué)成分定量分析的新技術(shù)，每秒可測(cè)上萬(wàn)細(xì)胞信息，從一個(gè)細(xì)胞中，可同時(shí)測(cè)量多種參數(shù)，并可以快速分選細(xì)胞。,激光共聚焦顯微鏡,線粒體,Hela 細(xì)胞,激光捕獲顯微切割技術(shù)（Laser capture microdissection，LCM）是近年發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù)。該技術(shù)可以在顯微鏡下快速地從由多細(xì)胞組成的組織中捕獲感興趣的單一

5、同類細(xì)胞群甚至單個(gè)細(xì)胞。這一技術(shù)迅速地被運(yùn)用到疾病發(fā)生的細(xì)胞和分子機(jī)制的研究之中。這將有利于提高疾病的診斷、治療及預(yù)后判斷的水平。,1、經(jīng)典組織化學(xué)2、免疫組織化學(xué)3、免疫電鏡組織化學(xué)4、原位雜交組織化學(xué)5、原位PCR技術(shù),,現(xiàn)代組織化學(xué)的內(nèi)容,組 織 化 學(xué)（Histochemistry）,一、組織化學(xué)的基本概念,（一）組織化學(xué)的定義 應(yīng)用化學(xué)或物理反應(yīng)原理，通過(guò)顯示組織或細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)成分或酶活性，對(duì)其進(jìn)行定性

6、、定位和定量研究。 ☆ 盡量保持組織的原有結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成 ☆ 組織原位 ☆ 借助顯微鏡 （二）組織化學(xué)與組織學(xué)、生物化學(xué)的區(qū)別,,組織化學(xué)：研究組織細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)組成及其含量、酶的存在及其活性組織學(xué)： 研究組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其與功能的關(guān)系生物化學(xué)：通常將組織和細(xì)胞破壞，制成勻漿進(jìn)行化學(xué)測(cè)定（不考慮定位）,,,,,,（三）組織化學(xué)的基本原理,化學(xué)試劑,+,擬檢物質(zhì),反應(yīng)產(chǎn)物沉淀

7、（有色）,化學(xué)反應(yīng),（組織切片或細(xì)胞涂片、爬片）,（擬檢物質(zhì)所在處）,（四）組織化學(xué)技術(shù)的基本要求,保持組織和細(xì)胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)，保持組織和細(xì)胞生前的化學(xué)成分和酶的活性反應(yīng)產(chǎn)物不被溶解、不易位、不彌散，保證反應(yīng)產(chǎn)物的精確定位反應(yīng)產(chǎn)物具有可視性，反應(yīng)產(chǎn)物的顏色深度與相應(yīng)物質(zhì)含量或酶的活性具有一定的量效關(guān)系所用組織化學(xué)方法必須具備一定的特異性（僅與某種化學(xué)成分發(fā)生反應(yīng)）和靈敏性（能夠顯示微量的物質(zhì)）方法穩(wěn)定并能重復(fù)設(shè)置必要的對(duì)照實(shí)

8、驗(yàn),,1、固定的目的： 1）保持組織細(xì)胞原有的形態(tài)結(jié)構(gòu) 2）使組織硬化2、固定的優(yōu)、缺點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)：使組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)得到保持 缺點(diǎn)：擬檢物質(zhì)反應(yīng)性減弱，酶的活性易受損,,取材：位置準(zhǔn)確、速度快、減少擠壓、大小適中（寧可面積大、不能厚）,二、組織化學(xué)標(biāo)本的制備,(一) 取材與固定,固定液的種類很多。可分為單純固定液和混合固定液兩大類。單純固定液：是用一種化學(xué)試劑作為固定液，如甲醛溶液、乙醇

9、、冰醋酸等。它們只是對(duì)細(xì)胞的某種成分固定得較好，不能將細(xì)胞所有的成分都保存下來(lái)。如升汞固定蛋白質(zhì)、冰醋酸固定核蛋白、無(wú)水乙醇可固定糖原等，單純固定液有一定局限性。 混合固定液：是用幾種化學(xué)試劑，按一定的比例混合配制而成的，由于各種試劑的優(yōu)缺點(diǎn)互相彌補(bǔ)，因此可產(chǎn)生更好的效果。,3、常用固定劑,☆ 10%中性緩沖福爾馬林：甲醛實(shí)際濃度為4％ [甲醛原液10ml, 0.1mol/L磷酸緩沖液(PB, pH7.4) 90ml混勻]

10、 ☆ 4%多聚甲醛[（HCHO)n，n=8~100]：多聚甲醛40g, 0.1mol/L PB 500ml，兩者混合加熱至60℃，攪拌并滴加1mol/L NaOH至溶液清澈，補(bǔ)充0.1mol/L PB至總量1000m1 ☆ PB和PBS是最常用的緩沖液， 0.01mol/L PBS主要用于漂洗組織標(biāo)本、稀釋抗體和血清等。 0.1mol/L PB常用于配制固定液及蔗糖等。,為減少固定劑與抗原的交聯(lián)，在使用醛

11、類固定劑時(shí)，應(yīng)縮短固定時(shí)間(8～24h)，降低固定溫度(4℃)。,2）戊二醛：C3H10(CHO)2,2?4%戊二醛溶液：較好的保存細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，但是保存酶活性效果不佳。,1）甲醛：HCHO,3) Bouin’s液 苦味酸飽和水溶液 75ml 甲醛 25ml 冰醋酸 5ml 是常用的良好固定液，滲透速度快，收縮小，組織固定均勻，不使組織變硬變脆，保

12、持結(jié)構(gòu)完整，適合于各種胚胎連續(xù)切片，對(duì)于肝、皮、胰腺特殊染色效果好。固定為12～24小時(shí)，但固定過(guò)久，對(duì)堿性染料著色不利。,4）Carnoy氏液 純酒精 60ml 氯仿 30ml 冰醋酸 10ml 此固定液滲透速度快，2mm以下小塊組織固定時(shí)間2～4小時(shí)，它是細(xì)胞極好的固定液，適合于細(xì)胞分裂、RNA、DNA及糖元等固定。固

13、定后直接入純酒精脫水。,5）乙醇：CH3CH2OH,培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞涂片、冰凍切片的固定4%PFA 、甲醇、乙醇、丙酮,有固定和脫水的雙重作用。能較好的保存酶活性和糖原，但會(huì)使組織嚴(yán)重收縮和硬化，常與其它固定劑混合使用,甲醇：CH3OH,既可作固定劑，又可作脫水劑。能使蛋白凝固，但不影響蛋白質(zhì)的反應(yīng)功能基團(tuán)而保存酶的活性。缺點(diǎn)是易使組織細(xì)胞收縮，保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)欠佳。4℃下10分鐘。,6）丙酮：(CH3)2CO,1、石蠟切片： 組織

14、取材和固定（甲醛） → 脫水（梯度酒精） → 透明（二甲苯） → 浸蠟（石蠟） → 包埋（石蠟） → 切片（石蠟切片機(jī)） → 粘片（載玻片） → 烤片（烤箱） → 組織化學(xué)染色程序,,,,,,,,,,,,,,,組織結(jié)構(gòu)保存良好，結(jié)構(gòu)清晰，定位準(zhǔn)確，方便標(biāo)本長(zhǎng)期保存。,,（二）組織切片的制備,石蠟切片：組織取材和固定（甲醛） → 脫水（梯度酒精） → 透明（二甲苯）

15、 → 浸蠟（石蠟） → 包埋（石蠟） → 切片（切片機(jī)） → 粘片（載玻片） → 烤片（烤箱） → 組織化學(xué)染色程序,石蠟切片：組織取材和固定（甲醛）→ 脫水（酒精）→ 透明（二甲苯）→ 浸蠟（石蠟）→ 包埋（石蠟）→ 切片（切片機(jī)）→ 粘片（載玻片）→ 烤片（烤箱） → 組織化學(xué)染色程序,以肉眼可見自然光線基本透過(guò)樣品為宜,松節(jié)油代替二甲苯：作用柔和,制片材料不易硬化，避免二甲苯對(duì)人體和環(huán)境的危害,

16、石蠟切片： 組織取材和固定（甲醛）→ 脫水（酒精）→ 透明（二甲苯）→ 浸蠟（石蠟）→ 包埋（石蠟）→ 切片（切片機(jī)）→ 粘片（載玻片）→ 烤片（烤箱） → 組織化學(xué)染色程序,脫水、透明要充分，否則不利于浸蠟。但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)造成組織過(guò)硬和抗原損失。,,較軟的組織可選擇軟蠟（熔點(diǎn)42~50℃）較硬的組織可選擇硬蠟（熔點(diǎn)50~60℃）石蠟需要熔化過(guò)濾除去雜質(zhì),石蠟切片：組織取材和固定（甲醛）→ 脫水（酒精）→ 透

17、明（二甲苯）→ 浸蠟（石蠟）→ 包埋（石蠟）→ 切片（切片機(jī)）→ 粘片（載玻片）→ 烤片（烤箱） → 組織化學(xué)染色程序,包埋盒,包埋模具,石蠟切片：組織取材和固定（甲醛）→ 脫水（酒精）→ 透明（二甲苯）→ 浸蠟（石蠟）→ 包埋（石蠟）→ 切片（切片機(jī)）→ 粘片（載玻片）→ 烤片（烤箱） → 組織化學(xué)染色程序,必要時(shí)哈氣、或冰凍,石蠟切片：組織取材和固定（甲醛）→ 脫水（酒精）→ 透明（二甲苯）

18、→ 浸蠟（石蠟）→ 包埋（石蠟）→ 切片（切片機(jī)）→ 粘片（載玻片）→ 烤片（烤箱） → 組織化學(xué)染色程序,40~45℃,粘片劑,石蠟切片： 組織取材和固定（甲醛）→ 脫水（酒精）→ 透明（二甲苯）→ 浸蠟（石蠟）→ 包埋（石蠟）→ 切片（切片機(jī)）→ 粘片（載玻片）→ 烤片（烤箱） → 組織化學(xué)染色程序前的處理→ 組織化學(xué)染色,如37度過(guò)夜,組織化學(xué)染色程序前的處理: → 脫蠟（二甲苯） → 純酒

19、精置換二甲苯 → 梯度酒精入水 → 組織化學(xué)染色程序 → 常規(guī)脫水、透明、封片,2、 恒冷箱冰凍切片 組織取材和固定或不固 定→驟凍（液氮，– 198℃；干冰，–78℃； 凍結(jié)金屬座，–30℃） → 切片（恒冷箱） → 粘片（載玻片） → 晾片 → 組織化學(xué)染色程序 → 常規(guī)脫水、透明、封片,能夠完好地保存細(xì)胞膜表面和細(xì)胞內(nèi)多種酶的活性，以及抗原的免疫活性（注意抗體的選擇），

20、能夠很好地保存脂肪、類脂等成分步驟更簡(jiǎn)單，快速、省時(shí)冰凍過(guò)程容易使組織中的水分形成冰晶，破壞組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，造成抗原的彌散，從而定位不準(zhǔn)確組織過(guò)大不容易凍結(jié)或組織凍結(jié)不均，影響切片及染色效果。不容易制作較薄的切片，不容易做連續(xù)切片，不容易長(zhǎng)期保存,冰凍切片的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn),,,糖類顯示法,,過(guò)碘酸是一種強(qiáng)氧化劑，可將糖分子中的乙二醇基氧化成乙二醛基，后者再與Schiff試劑中的亞硫酸品紅（無(wú)色）反應(yīng)，形成不溶性紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物,

21、對(duì)照：先用唾液淀粉酶滴于切片上， 37 ℃ 30 ~60min，再按實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行。,最常用于顯示細(xì)胞、組織內(nèi)的多糖和蛋白多糖的方法是過(guò)碘酸-雪夫反應(yīng)（periodic acid Schiff，PAS反應(yīng))。,脂類物質(zhì)顯示法,蘇丹黑B 為脂溶性染料，染色后與組織中的脂類物質(zhì)結(jié)合，故組織中含脂類物質(zhì)處呈黑色。,脂類物質(zhì)包括脂肪與類脂。標(biāo)本可用甲醛固定、冷凍切片、用油紅O、蘇丹黑B等脂溶性染料染色；亦可用鋨酸固定兼染色，脂類呈黑色。,油紅O是

22、很強(qiáng)的脂溶劑和染脂劑，與甘油三酯結(jié)合呈小脂滴狀，在脂類中的溶解度比在溶劑中大。當(dāng)組織切片置人染液時(shí)，染料則離開染液而溶于組織內(nèi)的脂質(zhì)(如脂滴)中，使組織內(nèi)的脂滴呈橘紅色,Feulgen反應(yīng)顯示DNA,用稀鹽酸處理切片，使DNA水解，打開脫氧核酸與嘌呤堿基之間的連接鍵（糖苷鍵），形成醛基，再與Schiff試劑作用，形成紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物。,常用核酸組織化學(xué),吖啶橙染色顯示DNA和RNA,吖啶橙（acridine orange，AO）是一種常用

23、熒光染料，與細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA都有親和力，但有一定的特異性，即結(jié)合后發(fā)不同顏色的熒光，DNA呈亮（黃）綠色，而RNA呈橘紅色至火紅色。此法簡(jiǎn)便快捷，既可染活細(xì)胞又可染固定的細(xì)胞。,Hoechst33258 和Hoechst33342顯示DNA,Hoechst 33342 和 33258主要的特點(diǎn)是能夠穿透完整的細(xì)胞膜，所以可以用來(lái)染活細(xì)胞，許多種類的干細(xì)胞（如NSC等）由于可以更有效地將進(jìn)入細(xì)胞的Hoechst染料主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，

24、所以染色會(huì)弱一點(diǎn)，但染固定過(guò)的細(xì)胞則沒有區(qū)別。 Hoechst 33342 比 33258更容易透過(guò)細(xì)胞膜，所以常用來(lái)進(jìn)行活細(xì)胞的 DNA含量分析。染活細(xì)胞時(shí)，不同種類的細(xì)胞攝入Hoechst的效率不同，染色的強(qiáng)度也不一樣，在做細(xì)胞流式的時(shí)候會(huì)看到不同的信號(hào)峰。,LABELING LIVE CELLS : Labeling DNA with Hoechst 33342,亮藍(lán)色熒光,DAPI顯示DNA,DAPI是一種可以穿透細(xì)胞

25、膜的藍(lán)色熒光染料，可用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。 DAPI像Hoechst染料一樣，粘附在DNA雙螺旋的小溝區(qū)，是一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料。,與雙鏈DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生比DAPI自身強(qiáng)20多倍的熒光,碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）,PI檢測(cè)試劑盒可用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)，也可用于普通的細(xì)胞核染色以及某些特定情況下的雙鏈DNA染色，染色后可用熒光顯微鏡檢測(cè)或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。PI是一種DNA結(jié)合性染料，其激發(fā)

26、和發(fā)射波長(zhǎng)分別為488nm和630nm，產(chǎn)生紅色熒光，但無(wú)膜通透性，不能透過(guò)活細(xì)胞膜，只能染死細(xì)胞。,The green is the microtubule network (part of the cell cytoskeleton) stained with an antibody to tubulin. The red is the nucleus stained with propidium iodide.,正常細(xì)胞：

27、 不能著色早期凋亡細(xì)胞：呈微弱紅光晚期凋亡細(xì)胞：紅光加強(qiáng)壞死細(xì)胞： 呈強(qiáng)紅色熒光,酶組織化學(xué),酶組織化學(xué)基本反應(yīng)原理 酶特異性底物 + 相關(guān)捕獲劑 反應(yīng)產(chǎn)物沉淀（有色） 反應(yīng)產(chǎn)物沉淀（無(wú)色）+置換劑,酶,,（孵育液內(nèi)）,,（組織細(xì)胞內(nèi)）,鏡下觀察,,有色沉淀,,,,酶組織化學(xué)是顯示酶的活性,一、金屬-金屬鹽顯示

28、法,酶作用于底物時(shí)，其分解產(chǎn)物與底物混合液中某種物質(zhì)結(jié)合，沉著在作用部位。然后結(jié)合物被金屬置換，通過(guò)金屬顯色來(lái)證明酶的存在?；蛘?，酶作用于底物后生成的分解產(chǎn)物，與底物孵育液中的金屬離子相結(jié)合，直接沉著于酶反應(yīng)部位，使其顯色（鈣-鈷法、鉛法）。,如：磷酸酶分解磷酸底物后，可與鉛/鈷形成磷酸鉛，在硫存在時(shí)形成 PbS或CoS的棕黑色沉淀，從而標(biāo)出酶所在部位。,二、偶聯(lián)偶氮色素法,用人工合成的酶底物，在酶的作用下產(chǎn)生分解產(chǎn)物，后者與重氮鹽結(jié)合

29、，引起偶氮偶聯(lián)反應(yīng)，而形成不溶性的偶氮色素。 α萘基磷酸鈉 磷酸氫二鈉＋α萘酚 α萘酚＋FAST BLUE 偶氮染料↓,堿性磷酸酶＋水,,,,,β-磷酸萘酚,α-萘基氯化重氮鹽,不溶性偶氮色素,,酶作用,,三、色素形成法,四唑鹽法 主要用于顯示脫氫酶。底物中含有四唑鹽或雙四唑鹽。在脫氫酶的作用下，底物釋出氫原子，并與四唑鹽或雙四唑鹽形成

30、紅色或藍(lán)色的甲 （càn）或二甲 色素。,C6H5—C,,,,N—N—C6H5,N＝N—C6H5,,酶作用,,+2H,C6H5—C,,,,N—NH—C6H5,N＝N—C6H5,+ HCl,四唑鹽(無(wú)色),甲 （紅色）,靛酚藍(lán)法：,H3C CH3,,,N,,,,,,,,,,N,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,H3C CH3,,,N,,,,,,,,,,NH2,,,,,,,,,,,,,

31、,,,,,,OH,+,酶作用,,+ 2H2O,二甲基–對(duì)–苯二胺,?-萘酚,靛酚,,,O,O2,,細(xì)胞色素氧化酶過(guò)氧化物酶,酶組織化學(xué)注意事項(xiàng)1.選擇最適溫度、pH值及緩沖液2.為保持酶活性，最好使用冰凍切片，固定時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)3.有些物質(zhì)能提高或抑制酶的活性，故要選擇合適的捕捉劑4.進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)：用酶的抑制劑、用去底物的孵育液、用已確定含該酶的組織細(xì)胞進(jìn)行對(duì)照,,免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry）,第一

32、節(jié) 概述,一、免疫組織化學(xué)的基本概念,免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry) 又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，其主要原理是用熒光素、酶、膠體金等標(biāo)記的抗體檢測(cè)細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，經(jīng)過(guò)組織化學(xué)的呈色反應(yīng)之后，用光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡或電子顯微鏡觀察，進(jìn)行定性、定位或定量分析。通過(guò)免疫組織化學(xué)手段，凡是能作抗原、半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受體及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體在組織、細(xì)胞內(nèi)將其檢

33、出和對(duì)其進(jìn)行研究。,二、免疫組織化學(xué)的免疫學(xué)依據(jù),,,,,,,,,,,抗原,抗體,抗原 – 抗體復(fù)合物,,＋,,,抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性,三、免疫組織化學(xué)的基本原理,,,,,,,,,,,,組織抗原,標(biāo)記物,被標(biāo)記的抗體,標(biāo)記抗體與組織抗原特異性結(jié)合,,,,,,利用免疫學(xué)中抗原與抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)以及組織化學(xué)的原理，在組織或細(xì)胞標(biāo)本中加入特定的標(biāo)記抗體，然后對(duì)標(biāo)記物進(jìn)行顯示，從而對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原物質(zhì)進(jìn)行定性、定位或定量

34、研究。,第二節(jié) 抗原和抗體,,抗原（antigen）,,一、抗原的定義： 免疫原性和反應(yīng)原性,完全抗原 和 半抗原或不完全抗原,半抗原和大分子蛋白質(zhì)結(jié)合以后，就獲得了免疫原性,能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答并能與相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)。,,,,,,二、抗原的特異性,抗原決定簇或表位,三、抗原的異物性： 抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)必須與宿主自身物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)相異,1、異種物質(zhì)，異種抗原,2

35、、同種異體物質(zhì)，異體抗原,3、自身物質(zhì)，自身抗原,決定抗原特異性的基本結(jié)構(gòu)或化學(xué)基團(tuán),抗體（antibody）,重鏈（heavy chain, H chain）輕鏈 (light chain, L chain)氨基端 (N端)羧基端 (C端)可變區(qū) (variable region, V區(qū))穩(wěn)定區(qū) (constant region, C區(qū)),漿細(xì)胞合成、分泌的一類能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有

36、免疫功能的球蛋白（immunoglobulin, Ig）,IgA, IgD, IgG, IgE, IgM,F(ab‘)2段Fc'段,抗體經(jīng)酶水解后的產(chǎn)物,,Fab即抗原結(jié)合片段（fragment antigen binding），由一條完整的輕鏈和部分重鏈（VH和CH1）組成。該片段具有單價(jià)抗體活性，能與一個(gè)相應(yīng)的抗原決定族特異性結(jié)合。Fc即可結(jié)晶片段（fragment crystalline），F(xiàn)c段含有兩條重

37、鏈C端的一半，包含CH2和CH3兩個(gè)功能區(qū)，它無(wú)抗體活性。Ig在異種間免疫所具有的抗原性主要存在于Fc段，同時(shí)Fc段還具有活化補(bǔ)體、親細(xì)胞、通過(guò)胎盤和介導(dǎo)與細(xì)菌蛋白結(jié)合等生物學(xué)活性。,用木瓜蛋白酶水解IgG分子，可將其裂解為2個(gè)完全相同的Fab和1個(gè)Fc片段。,抗體(antibody)多克隆抗體(polyclonal antibody) 純化的抗原直接免疫動(dòng)物（大多數(shù)為兔）多個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。特異性不如單克

38、隆抗體好，有時(shí)會(huì)造成一定的交叉反應(yīng)，但靈敏度、穩(wěn)定性高于后者。能廣泛用于石蠟包埋組織切片。單克隆抗體(monoclonal antibody) 單克隆抗體是由一個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆分泌的針對(duì)一種抗原決定簇的抗體。大多數(shù)為小鼠Ig。其優(yōu)點(diǎn)為特異性強(qiáng)、抗體產(chǎn)量高。但靈敏度遜于多抗。在免疫組織化學(xué)中廣泛用于冰凍切片和石蠟切片。,多克隆抗體（polyclonal antibody, PcAb）大多數(shù)天然抗原物質(zhì)往往具有多種不同的

39、抗原決定簇，而每一決定簇都可刺激機(jī)體產(chǎn)生一種特異性抗體。多克隆抗體是多個(gè)抗原決定簇刺激機(jī)體后，由多個(gè)免疫淋巴細(xì)胞分泌的多種抗體的混合物。 PcAb 特異性相對(duì)較差，易出現(xiàn)交叉反應(yīng)。,由單一克隆B細(xì)胞雜交骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)生的，只識(shí)別一種抗原表位的具有高度特異性的抗體。,制備單一表位特異性抗體的理想方法是獲得針對(duì)單一表位的漿細(xì)胞克隆，使其在體外擴(kuò)增并分泌抗體。但漿細(xì)胞在體外的壽命較短，也難以培養(yǎng)。于是，將可產(chǎn)生特異性抗體但短壽的漿

40、細(xì)胞與無(wú)抗原特異性但長(zhǎng)壽的惡性漿細(xì)胞瘤細(xì)胞融合，建立了可產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞和單克隆抗體技術(shù)。,單克隆抗體（monoclonal antibody, McAb）,優(yōu)點(diǎn)：結(jié)構(gòu)均一、純度高、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、易大量制備。,基因工程抗體（genetic engineering antibody）,第三代抗體，利用基因工程技術(shù)制備而來(lái)。是指應(yīng)用DNA重組及蛋白工程技術(shù)對(duì)編碼抗體的基因按不同的需要進(jìn)行改造和裝配，經(jīng)導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞后重

41、新表達(dá)的抗體。包括人源化抗體、小分子抗體、雙價(jià)特異性抗體和抗體融合蛋白等的制備。,,第三節(jié) 免疫組織化學(xué)技術(shù)的原理,,最原始的免疫組織化學(xué)技術(shù)可概括為:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,直接法,間接法,簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)、非特異性背景反應(yīng)低敏感性低，難以檢測(cè)抗原量少的樣品,1. 因第二抗體的放大作用，敏感性大大增高 2. 一個(gè)標(biāo)記二抗能與多種產(chǎn)生于同一種屬動(dòng)物的一抗結(jié)合，其成本更低。,免疫組織化學(xué)技術(shù)包括：

42、一、免疫熒光技術(shù) 二、免疫酶技術(shù) 三、親合素-生物素技術(shù) 四、免疫膠體金技術(shù),常用免疫組織化學(xué)染色步驟： A、一步法 B、二步法 C、三步法 D、多步法,一、免疫熒光技術(shù),將熒光作為標(biāo)記物的免疫組織化學(xué)技術(shù),當(dāng)某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長(zhǎng)的入射光(激發(fā)光，通常是紫外線或X射線)照射，吸收光能后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光的波長(zhǎng)長(zhǎng)的出射光(發(fā)射光，通常波長(zhǎng)在可見光波

43、段)；而且一旦停止入射光，發(fā)光現(xiàn)象也隨之立即消失。具有這種性質(zhì)的出射光就被稱之為熒光。,FITC,TRITC,（一）直接法1、抗原直接定位法,,組織中的抗原,,,2、抗體直接定位法,熒光標(biāo)記的抗原,組織中的抗體,,（二）間接法1、抗原間接定位法,,,,,,,,熒光標(biāo)記的第二抗體 （二抗）,組織中的抗原,,,,,,,,,,,,,第一抗體（一抗）,,,,,,2、抗體間接定位法,,,,,,熒光標(biāo)記抗體,組織中的抗體,,,,,,

44、抗原,,,,,,,,,,,,,（三）免疫熒光雙標(biāo)記法,1、直接法,,,,,,,,,,,,,,,,,2、間接法,,免疫熒光雙標(biāo)記法的應(yīng)用： 1.將兩種抗體分別用不同的熒光素加以標(biāo)記，用來(lái)顯示含有不同成分的兩種細(xì)胞在同一區(qū)域的定位模式,激光掃描共聚焦顯微鏡觀察,免疫熒光雙標(biāo)記法的應(yīng)用： 2. 將兩種抗體分別用不同的熒光素加以標(biāo)記，用來(lái)定位同一細(xì)胞內(nèi)存在的兩種不同成分,激光掃描共聚焦顯微鏡觀察,熒光顯微鏡,透射式熒光顯微

45、鏡,落射式熒光顯微鏡,透射式熒光顯微鏡,透射式：低倍鏡時(shí)熒光強(qiáng)，隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱落射式：視野照明均勻，成像清晰，放大倍數(shù)愈大熒光愈強(qiáng),用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光,在照明系統(tǒng)的光源中使用高壓汞燈提供全波段激發(fā)光,阻斷濾片吸收和阻擋殘余激發(fā)光進(jìn)入目鏡，選擇并讓特異的熒光透過(guò),雙色束分離器使激發(fā)光和熒光分開,每種熒光物質(zhì)都有一個(gè)產(chǎn)生最強(qiáng)熒光的激發(fā)光波長(zhǎng)，所以需加用激發(fā)濾片(如藍(lán)色、綠色激發(fā)濾片)，僅使一定波長(zhǎng)的激發(fā)光透過(guò)照

46、射到標(biāo)本上，而將其他光都吸收掉,為延長(zhǎng)汞燈壽命，打開后不可立即關(guān)閉(至少15min)，以免水銀蒸發(fā)不完全而損壞電極；汞燈關(guān)閉后則不可馬上打開(至少30min)，否則燈內(nèi)汞蒸汽尚未恢復(fù)液態(tài)，內(nèi)阻極小，再次施加電壓會(huì)引起短路，導(dǎo)致汞燈爆炸。,熒光顯微鏡的基本構(gòu)造是由普通光學(xué)顯微鏡加上一些附件(如熒光光源 、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎(chǔ)上組成的。,激光共聚焦顯微鏡,采用點(diǎn)掃描技術(shù),用十分細(xì)小的激光束(點(diǎn)光源)逐點(diǎn)逐行掃描成像,再

47、通過(guò)微機(jī)組合成一個(gè)整體平面的或立體的像，清晰度和精密度大大提高。而傳統(tǒng)的光鏡是在場(chǎng)光源下一次成像的,標(biāo)本上每一點(diǎn)的圖像都會(huì)受到相鄰點(diǎn)的衍射光和散射光的干擾。圖像數(shù)字化,在電腦中進(jìn)行處理,提高圖像的清晰度和分析的便利度。利用光電倍增管將很微弱的信號(hào)放大,使靈敏度大大提高 光學(xué)成像的分辨率提高30%-40%用于觀察細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形態(tài)的測(cè)量等。,激光的單色性非常好,光源波束的波長(zhǎng)相同,從根本

48、上消除了色差。,采用共聚焦技術(shù)在物鏡的焦平面上放置了一個(gè)當(dāng)中帶有小孔的擋板,將焦平面以外的雜散光擋住,消除了球差,用于激發(fā)熒光的激光束透過(guò)入射小孔被二向色鏡反射，通過(guò)顯微物鏡匯聚后入射于待觀察的標(biāo)本內(nèi)部焦點(diǎn)處。激光照射所產(chǎn)生的熒光和少量反射激光一起，被物鏡重新收集后送往二向色鏡。其中攜帶圖像信息的熒光由于波長(zhǎng)比較長(zhǎng)，直接通過(guò)二向色鏡并透過(guò)出射小孔到達(dá)光電探測(cè)器(通常是光電倍增管PMT)，變成電信號(hào)后送入計(jì)算機(jī)。而由于二向色鏡的分光作用，

49、殘余的激光則被二向色鏡反射，不會(huì)被探測(cè)到。,二、免疫酶技術(shù),常用作標(biāo)記物的酶有： 辣根過(guò)氧化物酶(HRP) 堿性磷酸酶 (AP),,抗原抗體免疫結(jié)合反應(yīng) + 酶組織化學(xué)反應(yīng),H2O2和DAB (diaminobenzidine, 二氨基聯(lián)苯胺)為其常用底物，產(chǎn)物為穩(wěn)定的棕黃色沉淀,辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）,BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indo

50、lyl-phosphate，5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽) 和 NBT（Nitro-Blue-Tetrazolium，四唑氮藍(lán)）是AP的常用底物組合。,BCIP被AP水解成一種藍(lán)色的中間物，后者然后被NBT氧化形成二聚體（不溶性紫藍(lán)色沉淀）。,Phosphatase hydrolysis of BCIP is coupled to reduction of NBT, yielding a formazan and an indigo

51、 dye that together form a black-purple–colored precipitate.,堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, AP）,,,,（一）抗原間接定位法,,,,,,,,,,,,組織中的抗原,一抗,酶標(biāo)二抗,,,,,,,,,,,,,PAP法主要染色原理 ： 先將過(guò)氧化物酶和抗過(guò)氧化物酶抗體制成復(fù)合物； 用第二抗體作“橋梁”，既與第一抗體結(jié)合，再與

52、PAP復(fù)合物聯(lián)接，最后用底物顯色劑顯色。,非酶標(biāo)法：PAP法,過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶復(fù)合物 (peroxidase anti-peroxidase complex）,三、親和免疫組化,1、葡萄球菌蛋白A（SPA法）：用SPA代替橋抗體2、親合素–生物素技術(shù),,,,親合素（avidin）也稱卵白素，一種糖蛋白,生物素（biotin）即維生素H,,過(guò)氧化物酶(HRP),生物素與親合素有很高的親和力 一個(gè)親合

53、素分子上有四個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn),親合素–生物素–過(guò)氧化物酶復(fù)合物法(ABC法）,,,,組織抗原,,,,,,,,生物素化二抗,,,,,,,,ABC,一抗,,,,,,,,,,,,,,,,,,親合素作為“橋”將生物素化的抗體與生物素結(jié)合的酶連接起來(lái)，使抗原與抗體反應(yīng)信號(hào)放大，以增強(qiáng)敏感性,親和素－生物素過(guò)氧化物酶復(fù)合物法 (Avidin Biotin-peroxidase Complex, ABC) ABC法是利用親和素與

54、生物素特有的高度親和力這一生物學(xué)性質(zhì)，先將生物素與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合，形成生物素化HRP，然后與卵白素按一定比例混合，形成ABC復(fù)合物。然后通過(guò)生物素化二抗與特異性抗體（第一抗體）結(jié)合，再與ABC復(fù)合物聯(lián)結(jié)形成抗原-抗體-生物素化二抗-ABC。最后用底物顯色劑顯色。,鏈霉親合素–生物素–過(guò)氧化物酶復(fù)物法 (StreptAvidin Biotin-peroxidase Complex，SABC),此法為上述ABC法

55、的改良，是用鏈霉親合素（streptavidin ）代替ABC法中的親合素（avidin ）,,Streptavidin鏈霉親合素,,,,,,,,,,,,,,,,,,,avidin親合素,鏈霉親合素為蛋白質(zhì)，非糖蛋白，不與其它分子結(jié)合，可降低背景。,親合素是糖蛋白，含有約7%的糖類，可與組織中含糖基的物質(zhì)起反應(yīng)，造成背景著色。,1．用鏈霉親和素連結(jié)辣根過(guò)氧化物酶，則為： ＳＰ法：(StreptAvidin Perox

56、idase conjugataed method) 若用堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素則稱ＳＡＰ法。 若分別用堿性磷酸酶和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素，則稱ＤＳ法2．將鏈霉親和素和生物素先連結(jié)起來(lái)，則稱： ＬＳＡＢ法：labelled StreptAvidin-Biotin特點(diǎn): ⑴ 敏感性高，（比PAP高８～４０倍）； ⑵ 背景淡，鏈霉親和素更好；

57、 ⑶ 方法較簡(jiǎn)便，時(shí)間較短； ⑷ 應(yīng)用范圍廣，也可用于原位雜交和免疫電鏡。,鏈霉親合素-過(guò)氧化物酶（streptavidin peroxidase，S-P）技術(shù),,Streptavidin鏈霉親合素,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,酶標(biāo)鏈霉親合素,標(biāo)記親合素–生物素法（LAB法）,,,,,,,,過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親合素,生物素標(biāo)記（化）的抗體(二抗),組織抗原,,,,,,,,,,,,,,,一

58、抗,,,,,,,,,,第四節(jié) 免疫膠體金技術(shù),膠體金的制備： 氯金酸（HAuCl4或 AuCl3· HCl ) 還原劑 膠體金,,,?,?,?,?,?,?,?,,·,金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液,較小的膠體金顆粒基本是圓球形的，較大的膠體金顆粒(一般指30nm以上的)多呈橢圓形。,膠體金雙標(biāo)記法,,,,,,,一抗甲,金標(biāo)二抗甲,?,,,,,,,抗原乙,抗原甲,,,,

59、,,,?,一抗甲,金標(biāo)二抗乙,,,,,,,,,,,,,,,,,,?,?,第四節(jié) 光鏡免疫組織化學(xué)染色程序,以ABC法為例,,,,組織抗原,生物素化二抗,ABC,一抗,,,,,,,,,,,,,,,一抗：常用的多克隆，單克隆抗體,染色程序: 組織采用石蠟切片或恒冷箱切片,片厚5～10 ?m或者10 ～ 30 ?m 。 若石蠟切片則脫蠟到水冰凍切片：漂片or 貼片 1、 PBS漂洗, 10 min；,染色程序:

60、 2、 3%BSA, 30 min； 3、 0.2%Triton X-100, 3%H2O2處理，30 min; 4、 兔抗血清孵育過(guò)夜； 4、 PBS漂洗, 3?5 min； 5、生物素化羊抗兔IgG 孵育, 60 min； 6、PBS漂洗，3?5 min；,載玻片,,,,標(biāo)簽,組織切片,,,,,,,,,,,,,生物素化二抗,生物素,,Triton X-100為去污劑，其脂溶性可使細(xì)胞膜穿孔，增加細(xì)胞膜

61、對(duì)抗體的滲透性。 3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶 非免疫血清封閉（與二抗種屬相同的非免疫血清）阻止一抗被組織中富有電荷的膠原和結(jié)締組織成分吸附而導(dǎo)致的非特異性背景著色。,染色程序:7、 ABC復(fù)合物孵育, 60 min；8、 PBS漂洗, 3?5 min；9、 DAB?H2O2顯色液顯 色，至深棕色為止， 約5～10 min； （DAB?H2O2 臨用前配制）,,ABC,,,,標(biāo)簽,組織

62、切片,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,ABC,染色程序:10、先后經(jīng)自來(lái)水沖洗 和雙蒸水浸洗；11、常規(guī)脫水、透明、 樹膠封片。,染色結(jié)果：鏡下觀察。陰性對(duì)照試驗(yàn)： 1、常用空白試驗(yàn)：即用稀釋一抗的稀釋液， 如3% BSA等，或 PBS替代一抗，反應(yīng)應(yīng)呈陰性；,2、替代試驗(yàn)：正常兔血清或

63、 正常羊血清代替兔抗血清或羊抗兔IgG，反應(yīng)應(yīng)呈陰性；3、吸附試驗(yàn)：一抗血清經(jīng)相 應(yīng)抗原預(yù)吸附處理后孵育組織切片，反應(yīng)應(yīng)呈陰性。,結(jié)果判斷：同一公司不同批號(hào)的同種抗體，不同公司的同種抗體，結(jié)果可能不同，這時(shí)需要根據(jù)文獻(xiàn)、個(gè)人經(jīng)驗(yàn)、western blot的結(jié)果等綜合判斷。假陽(yáng)性和假陰性：防止干片（免疫組化筆－Pap pen、濕盒）、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照。,SABC 步驟：

64、 (1) 石蠟切片脫蠟至水后； (2) PBS浸洗，5min×3次； (3) 3%過(guò)氧化氫溶液，10min；（去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶） (4) PBS浸洗，5min×3次； (5) 滴加10%正常非免疫動(dòng)物血清（與二抗同源）10min（封閉）； (6) 傾去血清，不洗！加第一抗體，37℃，30-60min；

65、 (7) PBS浸洗，5min×3次； (8) 加生物素化二抗，45～60min； (9) PBS浸洗，5min×3次； (10) 加ABC復(fù)合物，45～60min；或 (10)每張切片加1滴或50μl鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶溶液，10min； (11) PBS浸洗，5min×3次；

66、 (12) 新鮮配制的DAB-H2O2溶液，3～10min； (13) 自來(lái)水沖洗，復(fù)染，中性樹膠封固。,顯示劑的合理使用目前最常用的顯示劑用于辣根過(guò)氧化物酶（HRP）系統(tǒng) DAB： 3.3’-diaminobenizidine（3、3’-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽） AEC： 3-amino-9-ethlylcarbazde（ 3-氨基-9-乙基卡吧唑）用于堿性磷酸酶（AP）系統(tǒng) BCIP

67、（5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸)＋NBT(硝基四氮唑藍(lán))AP-Red和Fast-Blue （ α –萘酚AS-BI磷酸鹽＋快紅或快藍(lán)） AEC溶于酒精，所以封片時(shí)不能用中性樹膠，以免退色，而只能用甘油明膠或市售的AEC封片劑。,免疫組織化學(xué)組織細(xì)胞處理切片前的準(zhǔn)備工作,(1)載玻片的清潔： 市售載玻片需經(jīng)清潔液泡24h，流水沖洗，系列乙醇浸泡，涼干涂膠，如需開展原位雜交，還需將玻片240℃烤2 h。(2)切片粘

68、合劑的種類 多聚賴氨酸（分子量300KD）：0.5%濃度。 APES試劑（3-氨基、丙基三氧基硅烷）： 干凈載玻片→丙酮5min →APES（1ml+ 50ml丙酮）：用鑷子夾住浸入APES試劑1～3次→純丙酮洗二次→干燥玻片→用鋁箔包好，室溫或4℃保存?zhèn)溆谩?石蠟組織切片中抗原性的修復(fù)：A、化學(xué)方法： 胰蛋白酶（0.05～0.1% ，含0.1%CaCl2） 蛋白酶K、胃蛋白酶